[发明专利]杜鹃花枯萎病菌实时荧光PCR检测方法及其专用成套试剂

说明书

本发明公开了杜鹃花枯萎病菌实时荧光PCR检测方法及其专用成套试剂。本发明公开的检测杜鹃花枯萎病菌的成套试剂，由名称为OV的引物对和名称为OV‑P的探针组成，OV由名称分别为OV‑F和OV‑R的单链DNA组成；OV‑F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；OV‑R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；OV‑P的核苷酸序列为序列表的序列3。实验证明，本发明的成套试剂检测杜鹃花枯萎病菌快速简单、特异性强、灵敏度高，且还可以实现定量检测，对于杜鹃花枯萎病菌的检测以及防控具有重大的应用推广价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，杜鹃花枯萎病菌实时荧光PCR检测方法及其专用成套试剂。

背景技术

杜鹃花枯萎病菌Ovulinia azaleae Weiss，隶属于真菌门(Fungi)、子囊菌亚门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、柔膜菌目Helotiales、核盘菌科Sclerotiniaceae、卵孢核盘菌属Ovulinia。

杜鹃花枯萎病菌已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。目前，分布于美国、加拿大、阿根廷、德国、英国、比利时、法国、荷兰、日本、澳大利亚、新西兰。杜鹃花枯萎病菌主要为害花器，影响其观赏价值。

迄今为止，国内外检测杜鹃花枯萎病菌的方法局限于形态学检测方法，费时费力，需要15天以上，且容易漏检，出现假阴性结果，且对检测人员专业素质要求较高，难以满足快速、准确、灵敏鉴定的检测要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种杜鹃花枯萎病菌实时荧光PCR检测方法及其专用成套试剂。

本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂由名称为OV的引物对和名称为OV-P的探针组成，所述OV由名称分别为OV-F和OV-R的单链DNA组成；

所述OV-F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述OV-R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述OV-P的核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的序列。

所述OV-P的两端可分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团。具体的，所述OV-P的5'末端具有荧光报告基团FAM，3'末端具有荧光淬灭基团MGB。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

所述成套试剂的用途可为如下(b1)、(b2)、(b3)或(b4)：

(b1)鉴定杜鹃花枯萎病菌；

(b2)制备用于鉴定杜鹃花枯萎病菌的试剂盒；

(b3)检测待测样本是否含有杜鹃花枯萎病菌；

(b4)制备用于检测待测样本是否含有杜鹃花枯萎病菌的试剂盒。

上述成套试剂中，所述OV-F、所述OV-R、所述OV-P均可独立包装。所述OV-F、所述OV-R、所述OV-P的摩尔比可为1:1:1。