[发明专利]耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的快速通量筛选方法

说明书

本发明提供一种耐高温高酸型柠檬酸生产菌株的快速筛选方法，包括配制培养基、选择亲本菌株、制备融合菌株、融合菌株初步筛选、耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的筛选、摇瓶发酵复筛与菌株遗传稳定性测试、以及任选的再次诱变选育步骤。本发明应用初筛、复筛和再次诱变相结合的高通量快速筛选法得到高产型的耐高温耐高悬性能菌株，以高温下培养的选择培养基指示圈的大小作为初筛依据进行高通量大规模淘汰，结合HPLC测定法准确选取高产菌株，从而提高筛选效率。本发明高通量快速筛选方法操作简单、高效，且诱变菌株定向性高，具有重要的生产价值。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及耐高温高酸型柠檬酸生产菌株的快速筛选方法。

背景技术

柠檬酸化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，被广泛应用于食品、医药和化工等行业，是世界上以生物化学方法生产量最大的有机酸。近年来，柠檬酸的需求量越来越大。目前，生产柠檬酸的主要方法有化学合成法和生物发酵法。化学合成法使用大量的化学试剂，并且合成步骤繁琐、原料较贵，难以应用于食品生产，生物发酵法工艺成熟、成本低廉、产量大，大量供应食品工业。目前市场上90％以上的柠檬酸都是通过生物发酵法生产的。

黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产柠檬酸、淀粉酶、酸性蛋白酶等多种产品，其中全球80％以上的柠檬酸是由黑曲霉发酵得到的。但是，当前柠檬酸生产用菌株多为不耐高温菌株，柠檬酸发酵过程是产热的过程，在这个过程中需要大量的循环冷却水以维持发酵温度。因此发酵生产过程中需要大量冷却水控制发酵温度。在国内，柠檬酸菌种一般选用黑曲霉(Aspergillus niger)，该菌种的发酵温度目前是37.5℃左右。提高发酵温度可大幅减少循环冷却水，循环冷却水用量的减少降低了水耗和运转能耗，同时也节约了设备投资。提高柠檬酸菌种黑曲霉的耐热性，将发酵温度提高1-5℃，可节约大量的生产成本。而且，耐高温柠檬酸生产菌通常具有生长快、代谢活力高、发酵周期短的特点，有利于提高设备利用率，减少冷却水用量，降低生产成本。

黑曲霉作为传统的发酵工业菌种，对其进行菌种改良一直是研究热点。菌株的选育是发酵工业的关键技术，而国内的现有技术中对柠檬酸生产菌株的选育仍集中在提高菌株的产酸上。目前国内外对于高产型菌株的重点关注，对于耐高温菌株的研究应用较少。另外，由于发酵过程中产生柠檬酸以及其他杂质酸，导致发酵液pH下降，随着产酸量提高，严重影响了菌种的代谢和发酵。

因此，若能通过诱变育种的方法提高菌株的耐热耐酸性，并具有较高的产酸性，不仅可降低柠檬酸生成的耗能，还可提高柠檬酸产量，在柠檬酸工业中将具有较好的应用前景。

关于柠檬酸生产菌黑曲霉的筛选，国内外有很多报道，常规操作主要是采用物理和化学手段进行诱变育种。各种诱变剂有其作用的特殊性，在实际工作中一般都是根据结果验证来证明诱变效果较好的因素。目前对黑曲霉育种较为有效的诱变因子有：γ-射线、x-射线、紫外线、激光、亚硝基胍(NTG)、亚硝基脲、乙基胺等，此外还有高能电子流、电磁场等。利用这些诱变因子在黑曲霉育种工作中已取得了不少成果。例如上海工业微生物研究所从野生黑曲霉628作为出发菌株复合诱变获得了高产柠檬酸菌株Co827，产酸达12～13％。无锡工业大学以黑曲霉H-142为出发菌株，通过γ射线、硫酸二乙脂、高温单独或复合诱变处理，通过高温、高酸及高渗培养条件的定向筛选获得HQL-601菌种，它的发酵温度可达40℃。现有技术中的柠檬酸生产相关专利可举例如下。

CN107937325涉及一种柠檬酸杆菌菌株及其应用。该柠檬酸杆菌(Citrobactersp.)名称为除臭菌ZT-S5，于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.15120。本发明提供的柠檬酸杆菌菌种活力高，适应性强，可广泛用于水体和气体中硫化氢和氨的生物处理过程中。以该菌株吸附后制成的生物除臭装置，能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用