[发明专利]耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的快速通量筛选方法

权利要求书

1.一种快速筛选耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的方法，包括培养基配制、选择亲本菌株、制备融合菌株、融合菌株初步筛选、耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的二次筛选、摇瓶发酵复筛与菌株遗传稳定性测试，以及任选的再次诱变选育步骤，其中，所述产柠檬酸的菌株为黑曲霉菌，优选为诱变株；其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)配制培养基：

配制黑曲霉菌种筛选和发酵所需的各类培养基，所述培养基包括：PDA固体培养基、选择培养基、高酸型选择培养基、菌丝生长培养基、平板高渗培养基以及基于玉米粉液化液与液化清液的摇瓶发酵培养基；

其中，所述的高酸型选择培养基为选择培养基的基础上添加适量柠檬酸制得；

(2)选择亲本菌株:

选择黑曲霉亲本菌株，所述亲本菌株选择自耐高温型菌株、耐高酸型菌株、柠檬酸高产型菌株中的至少两种；

优选地，选自耐高温型黑曲霉菌株、耐高酸型黑曲霉菌株，更加优选地，至少其中一个菌株为柠檬酸高产型菌株；

(3)制备黑曲霉融合菌株：

黑曲霉融合菌株的制备包括黑曲霉原生质体的制备及灭活、原生质体融合三个步骤，具体步骤为：

S1：制备原生质体：

在PDA斜面上培养并选择生长良好的两亲本菌株孢子制成孢子悬浮液，稀释，取微量接种于菌丝生长培养基中，于35℃条件下的恒温摇床上培养24h；然后离心，将菌丝与培养基分离，并用0.8mol/LNaCl溶液作为渗稳剂洗涤菌丝，置于离心管中，加入复合酶液，恒温水浴振荡酶解2-3h，微滤膜过滤，离心，将滤液用渗稳剂洗涤，重悬，得到原生质体；

S2：紫外灭活：

将收集到的两亲株的原生质体分别稀释，置于培养皿中紫外照射一段时间进行紫外灭活，取适量悬浮液涂布高渗平板，控制灭活率99％以上，优选100％；

S3：原生质体融合：

取两亲本菌株的灭活原生质体悬液分别用渗稳剂离心洗涤，然后以10⁶个/ml的个数悬于电击液中，将每组两亲本菌株原生质体悬液等量混合摇匀，取少量注入融合仪电极小室进行电融合操作；

其中，电融合参数为：交变电场强度400V/cm，频率500KHz，高压直流脉冲幅值1.8KV/cm，脉冲持续时间60微秒；脉冲间隔3-4S，脉冲个数5-6个，每组电融合操作至少重复三次；将融合后的各组电融合液用微量进样器接种在高渗平板上，在32-35℃下培养4-6天得到融合子菌株；

(4)融合菌株初步筛选

将每组高渗平板上生长的融合菌株点种到选择培养基平板上，将所有选择培养基平板在40-45℃下培养3-4天，从每个选择培养基平板中挑选至少一组变色圈较大的菌落，从而得到多株经耐高温初步筛选的融合黑曲霉菌株；

(5)耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的筛选

包括耐高温高酸性能筛选和高产性能菌株的筛选两个步骤，具体步骤如下：

S1：耐高温高酸性能筛选

勾取上述经耐高温初步筛选的各融合菌配制成悬浮液，然后稀释并取适量均匀涂布于含溴甲酚绿的高酸型选择培养基上，40-44℃恒温培养箱中倒置培养2-3天，其中在高酸型选择培养基表面生长的菌落即为具有耐高温高酸性能的融合菌株；

S2：高产性能菌株的筛选

对于上述经耐高温高酸性能筛选后的批量菌株，采用快速高通量深孔板筛选的方法进一步筛选高产型柠檬酸的菌株；

其中，所述高产型柠檬酸菌株的筛选采用高效液相色谱仪(HPLC)测定柠檬酸含量；选取产酸量高于至少一个亲本株的菌株进行发酵复筛实验以及菌株遗传稳定性测试；

(6)摇瓶发酵复筛与菌株遗传稳定性测试

将上述步骤筛选出的多株耐高温高酸型柠檬酸高产菌株，接种到摇瓶内玉米粉清液摇瓶发酵培养基内，40-42℃下振荡培养3-4天，然后用HPLC法测定培养基中柠檬酸的产量，筛选得到在高温条件下产酸量不低于至少一个亲本株的融合菌株；

将筛选出的融合菌株分别进行PDA斜面传代8-10代，分别取2、3、5、7或8代斜面，再次进行摇瓶产酸测试，每组设三组平行实验，取平均值，40-42℃条件下的产酸水平稳定且产酸量较高的菌株予以保留，从而得到一株或多株耐高温高酸型柠檬酸高产菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对所得到的菌株进行进一步的诱变再筛选步骤。