[发明专利]检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法

说明书

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人PML‑RARa融合基因的试剂盒。本申请的采用PCR结合实时荧光探针技术，对临床外周血标本中的白血病相关融合基因PML‑RARa的RNA进行定量检测，从而辅助白血病临床诊断并指导相关白血病患者对临床药物的选择，具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势。

技术领域

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人PML-RARa融合基因的试剂盒及其使用方法。

背景技术

白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根据白血细胞的形态和生化特征，又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒－单核细胞白血病(CMML)等。

白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为2.76/10万人口，我国估计有5万以上患者，且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位，但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第1位。近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以，对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此，世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。

t(15；17)(q22；q12-21)易位，即15号染色体上的PML基因易位到17号染色体上的RARa基因上形成PML-RARa融合基因，约90％以上的APL患者中可检测到此融合基因，可作为APL诊断依据、疗效评价，以及监测白血病微小残留状态的分子指标。

目前对白血病的检查主要有血象检查、骨髓涂片检查、血液生化检查等，但这些都没有对融合基因进行检查，获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR和基因芯片等。

其中，FISH技术是利用已知的核酸探针，与组织、细胞染色体标本中相关核酸序列杂交，通过间接免疫荧光反应，直接定位基因，适用于多种临床标本，包括血液，骨髓、组织印片，甚至石蜡包埋的组织标本。由于FISH对处于分裂中期和间期细胞都能检测，克服了常规的细胞遗传学诊断淋巴瘤和白血病必须细胞处于分裂中期的障碍，但最低检出量较低，主要用于初诊和复发的检测。

PCR是检测融合基因的首选方法，不同类型的白血病和淋巴瘤存在不同的染色体易位，目前检测融合基因的主要PCR方法有巢式PCR方法，但这些大多是终点PCR方法，而且需要经过电泳检查，容易污染，极大地抑制了其在临床的广泛应用。

基因芯片方法是将许多白血病特异的探针固定在特定的介质上，利用分子之间相互识别的原理，来检测与探针相互作用的分子。通过基因芯片检查，可以发现病人骨髓中是否存在染色体易位。但目前该技术尚不够成熟，尤其是在PCR后的开管取样用于杂交，对其后的PCR反应，存在着很大的污染隐患，因此有一定的假阳性和假阴性率，且结果不容易解释，临床推广困难。

在荧光定量PCR技术普及前，很多研究学者采用竞争性定量PCR技术对融合基因进行定量分析，但竞争性定量PCR不仅耗时耗力，而且不利于标准化操作的建立，极大限制了其在临床上的应用。