[发明专利]呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法

说明书

本发明公开一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，包括以下步骤：配制细胞培养液；将猪小肠上皮细胞接种至细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；向待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin‑1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。本发明以呕吐毒素为诱导剂，成功建立猪小肠上皮细胞程序性坏死模型，具有操作简便、结果可靠、重复性好的优点。

技术领域

本发明涉及细胞模型构建技术领域，特别涉及一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法。

背景技术

细胞程序性坏死是一种由死亡受体介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡模式，通常在凋亡被抑制的情况下发生，死亡细胞具有明显的坏死特征。研究表明，细胞程序性坏死在缺血再灌注和炎症反应等多种因素导致的组织(如肝脏)损伤或坏死中发挥重要作用，有效抑制细胞程序性坏死对这些因素诱导的组织损伤或坏死具有重要的预防和治疗作用。肠道是机体营养物质消化吸收的重要场所，也是机体最大的免疫器官，在机体抵御病原微生物的入侵中发挥着重要作用，因此，建立肠细胞程序性坏死模型，对于研究肠道损伤机制和肠道疾病治疗具有十分重要的意义。

目前常用于诱导细胞程序性坏死的诱导剂包括融合蛋白、病毒转染系统和黍子籽粒蛋白，但是其中涉及复杂的诱导剂制备过程，包括构建载体、转染、诱导等许多步骤，以及涉及脱盐、阳离子交换层析和凝胶层析等繁琐步骤获得纯化蛋白的制备过程，因此，利用此类诱导剂构建细胞程序性坏死模型存在步骤繁琐或效果不稳定的缺点。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，旨在使猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的构建操作简便且效果稳定可靠。

为实现上述目的，本发明提出一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，包括以下步骤：

配制细胞培养液；

将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；

向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；

测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用。

优选地，配制细胞培养液的步骤，具体包括：

向DMEM/F-12培养基中加入5％的胎牛血清、1％的青链霉素混合液、1％的谷氨酰胺、0.1％的转铁蛋白以及5μg/L的表皮细胞生长因子，混合后制得细胞培养液。

优选地，将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养后，获得待诱导细胞的步骤，包括：

将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞；

对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2～3代，获得待诱导细胞。

优选地，将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞的步骤，具体包括：

取冻存的猪小肠上皮细胞在37℃水浴中复苏后，按3～4×10⁵个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70～80％，得培养细胞，其中，所述培养箱的培养条件设置为：CO₂的体积浓度为5％、培养温度为37℃、培养时长为2～3天，每隔20～26h更换一次细胞培养液。