[发明专利]呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法

权利要求书

1.一种呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

配制细胞培养液；

将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养，获得待诱导细胞；

向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞；

测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用；

其中，测定所述诱导处理细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶活力、claudin-1蛋白表达、以及程序性坏死关键基因的mRNA表达及其蛋白表达，判断呕吐毒素诱导对猪小肠上皮细胞程序性坏死的作用的步骤中：

所述程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1、受体相互作用蛋白3和磷酸化混合系列蛋白激酶结构域样蛋白；

所述猪小肠上皮细胞为IPEC-1；

向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤中：所述含有呕吐毒素的所述细胞培养液中，呕吐毒素的浓度为0.5μg/mL，诱导时长为48h。

2.如权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，配制细胞培养液的步骤，具体包括：

向DMEM/F-12培养基中加入5%的胎牛血清、1%的青链霉素混合液、1%的谷氨酰胺、0.1%的转铁蛋白以及5μg/L的表皮细胞生长因子，混合后制得细胞培养液。

3.如权利要求2所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将猪小肠上皮细胞接种至所述细胞培养液中培养后，获得待诱导细胞的步骤，包括：

将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70~80%，得培养细胞；

对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2~3代，获得待诱导细胞。

4.如权利要求3所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将猪小肠上皮细胞接种至含有所述细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70~80%，得培养细胞的步骤，具体包括：

取冻存的猪小肠上皮细胞在37℃水浴中复苏后，按3~4×10⁵个/mL的接种量接种至含有细胞培养液的培养板或培养皿中，置于培养箱中培养至细胞汇合率达到70~80%，得培养细胞，其中，所述培养箱的培养条件设置为：CO₂的体积浓度为5%、培养温度为37℃、培养时长为2~3天，每隔20~26h更换一次细胞培养液。

5.如权利要求3所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，对所述培养细胞进行传代培养至细胞传代至2~3代，获得待诱导细胞的步骤中：所述传代培养的培养时间为7~8天。

6.如权利要求1所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，向所述待诱导细胞中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞的步骤，具体包括：

将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养至细胞贴壁且长到70~80%后，再向孔板中加入含有呕吐毒素的所述细胞培养液，进行呕吐毒素诱导，获得经过呕吐毒素诱导处理后的诱导处理细胞。

7.如权利要求6所述的呕吐毒素诱导猪小肠上皮细胞程序性坏死模型的建立方法，其特征在于，将所述待诱导细胞接种至孔板中，加入所述细胞培养液进行培养的步骤中：所述待诱导细胞接种至所述孔板中的接种量为3~4×10⁴个/mL，所述细胞培养液在所述孔板中的添加量为80~120µL/孔。