[发明专利]一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法，其特征是基于重组酶介导的等温扩增技术并结合侧向层析试纸技术原理开发的。所述试剂盒包括RPA冻干粉末，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA反应缓冲液，硫酸镁溶液，侧向层析试纸，上样缓冲液，双蒸无菌水和蓝藻DNA。本发明利用冻裂法或微波法快速提取蓝藻DNA，15min内完成DNA的提取。本发明的扩增反应在30℃‑45℃的恒温条件下进行，20min内即可读取结果，无需依赖特殊仪器。本发明所述的试剂盒及其检测方法，灵敏度高，特异性强，操作简单，检测时间短，可应用于水源地及其他水体中蓝藻的现场快速检测。

技术领域

本发明涉及一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法，其特征是基于重组酶介导的等温扩增技术，可用于蓝藻的野外现场快速检测，可实现对蓝藻水华的监测和预警，属于水质监测技术领域。

背景技术

蓝藻是导致湖泊富营养化的主要藻类之一。近年来,世界各地的蓝藻水华爆发事件屡见不鲜，水华的防治已成为世界环境难题。水华的防治关键是如何建立有效的监测及早期预警技术，以期在其爆发前适时采取有效措施，降低水华带来的危害。

当前，水华蓝藻的监测技术主要分为以下四种：第一种是显微镜检测法，这种方法对采样的要求较高，而且方法的误差也较大。第二种是常规指标监测法，这些指标包括溶解氧，总氮，总磷，pH，叶绿素a 等。该方法具有一定的局限性，因为常规指标的变化并不一定预示着水华的发生。这第三种是卫星遥感监测技术，能够满足大范围监测的需要，能够减少人工采样的不便。但是，卫星影像的分辨率有限，易受天气影响。第四种是通过检测蓝藻分泌的藻毒素含量对蓝藻进行定量，常用的方法包括HPLC 法、LC/MS 法、ELISA 法、PCR 法等。这些方法能够满足高灵敏检测藻毒素的需要，对于蓝藻的检测具有重要参考意义。但是，以上方法均需要依赖于精密的检测仪器，无法应用于野外现场检测。因此，开发一种可适用于野外现场检测水中蓝藻的试剂盒及其方法是十分必要的。

重组酶聚合酶扩增反应(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种基于重组酶介导的等温扩增技术，该反应能在30℃-45℃的温度范围进行（人体腋下温度就可以反应），能够在15分钟内进行单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，可适用于蓝藻的快速检测。本发明提供的一种检测蓝藻试剂盒及其方法，是基于RPA技术并结合侧向层析试纸（lateral flow strips，LF）技术开发的，可实现对蓝藻的野外现场检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有蓝藻检测技术的不足，提供一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法，是基于重组酶介导的等温扩增技术并结合侧向层析试纸技术原理开发的，可适用于野外对蓝藻的现场检测。

一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒，所述试剂盒包括RPA冻干粉末，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA反应缓冲液，硫酸镁溶液，侧向层析试纸，上样缓冲液，双蒸无菌水和蓝藻DNA。

所述的RPA反应引物如表1所示，所设计的4对引物组合H1、H2、H3、H4均可以现实对蓝藻的特异性扩增，所有反向引物的5’端均用Biotin（生物素）标记。

所述的反向引物的标记方式不限于Biotin标记，也可以用其他标记物代替，如DIG、FITC、FAM等。

表1-引物序列

所述的RPA反应探针如表2所示，所有设计的探针在5’端均用FAM标记，用THF（四氢呋喃碱基）代替第33个碱基，用SpacerC3封闭3’端。

所述的RPA反应探针LF-P1可以适用于H1和H2引物组合，探针LF-P2可以适用于H1和H2引物组合，探针LF-P3可以适用于H1、H2、H3和H4引物组合。探针和引物组合按照上述的对应方式结合使用均可以特异性地检测蓝藻。