[发明专利]一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA冻干粉末，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA反应缓冲液，硫酸镁溶液，侧向层析试纸，上样缓冲液，双蒸无菌水和蓝藻DNA。

2.根据权利要求1所述的检测蓝藻的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应引物如表1所示，所设计的4对引物组合H1、H2、H3、H4均可以现实对蓝藻的特异性扩增，所有反向引物的5’端均用Biotin标记；所述的反向引物的标记方式不限于Biotin标记，也可以用其他标记物代替，如DIG、FITC、FAM等。

3.根据权利要求1所述的检测蓝藻的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应探针如表2所示，所有设计的探针在5’端均用FAM标记，用THF（四氢呋喃碱基）代替第33个碱基，用SpacerC3封闭3’端；所述的RPA反应探针LF-P1可以适用于H1和H2引物组合，探针LF-P2可以适用于H1和H2引物组合，探针LF-P3可以适用于H1、H2、H3和H4引物组合；探针和引物组合按照上述的对应方式结合使用均可以特异性地检测蓝藻；所述的探针的标记方式不限于FAM标记，也可以用其他标记物代替，如Biotin（生物素）、FITC、FAM等；所述的RPA反应探针3’端的封闭方式可以不限于SpacerC3，也可以用其他封闭方式代替，如磷酸盐、双脱氧核苷酸等。

4.根据权利要求1所述的检测蓝藻的试剂盒，其特征在于，所述侧向层析试纸前端包被有FAM抗体修饰的纳米金粒子，检测线上包被有Biotin抗体，质控线包被有固定抗体（可以与带抗体的纳米金粒子结合显色）；所述的侧向层析试纸前端包被的纳米金粒子上修饰的抗体不限于FAM抗体，可以用其他探针修饰的标记物的抗体代替；所述的侧向层析试纸的检测线上包被的抗体可以不限于Biotin抗体，可以用其他反向引物修饰的标记物的抗体代替。

5.一种基于等温扩增技术的检测蓝藻的方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行：

（1）快速裂解蓝藻DNA（以下两种方法均可快速获得蓝藻DNA）

冻裂法：取1 mL含蓝藻水样移至1.5 mL离心管，通过高速离心（13000 rpm/min，5-10min）收集蓝藻细胞，弃上清液，保留沉淀，加入50 μL双蒸水或细胞裂解液，重悬蓝藻细胞，将置于液氮或-80℃冰箱3-5 min，取出样品，于38-45℃水浴锅或金属浴中恒温放置1-2min，反复冻融操作3次，高速离心样品（13000 rpm/min，10 min），取上清液作为后续实验DNA样品；

微波法：取1 mL含蓝藻水样移至1.5 mL离心管，通过高速离心（13000 rpm/min，5-10min）收集蓝藻细胞，弃上清液，保留沉淀，加入50 μL细胞裂解液，重悬蓝藻细胞，将重悬的蓝藻样品置于一个带盖的微波炉专用盒中，盖上盖子，放进微波炉中750 W功率或中高温，加热1-3min，取出样品，放入离心机中，高速离心样品（13000 rpm/min，10 min），取上清液作为后续实验DNA样品；

（2）反应体系：RPA冻干粉末中加入RPA反应缓冲液（Rehydration Buffer）25-29.5 μL,10 μmol/L正向引物1-2.4 μL，10 μmol/L反向引物1-2.4 μL，10 μmol/L探针0.1-0.6μL，蓝藻DNA 0.5-2 μL，加双蒸无菌水补足体积至47.5 μL，离心混匀后，在盖子上添加280 mmol/L醋酸镁2.5 μL，颠倒8-10次，离心混匀；

（3）反应过程：反应体系置于30-45℃温度范围的恒温装置（如水浴，金属浴，人体腋下或其他恒温环境）孵育15-20 min，取出，将反应产物加上样缓冲液按50-200倍稀释，取10 μL直接加在侧向层析试纸的前端，将侧向层析试纸置于100-200 μL的上样缓冲液孵育2-8min，取出，即可通过肉眼直接读取结果；

（4）结果判定：当侧向层析试纸上只有质控线显色时，结果为阴性，说明检测的样品中不存在蓝藻；当侧向层析试纸上质控线和检测线同时显色时，结果为阳性，说明检测的样品中存在蓝藻；当侧向层析试纸上质控线不显色时，说明本次检测无效，需要重新检测。