[发明专利]一种注射用rhTNK-tPA冻干制剂及其制备方法

说明书

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种注射用rhTNK‑tPA冻干制剂及其制备方法，其包括分离纯化、配液、除菌过滤、灌装与半加塞和冻干步骤。经本发明制备方法制备得到的冻干制剂，外观良好，均匀，无分层、无明显萎缩和脱壁等情况，并且rhTNK‑tPA活性、纯度和回收率高，与现有技术相比，取得了显著的进步。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种注射用rhTNK-tPA冻干制剂及其制备方法。

背景技术

血栓的发病率和死亡率一直居于各类疾病之首，严重威胁了人类的生命健康。而目前公认的治疗血栓疾病最有效的方法之一是溶栓，在已上市的溶栓药物中PA类药物占主导地位，其中作为代表是广州铭康生物工程有限公司生产的第三代溶栓急救药物“铭复乐”，其是迄今最安全、最有效、一针救命的溶栓药物。

真空冷冻干燥(下称为冻干)由于能在低温及真空状态下完成对生物制品的脱水干燥，而成为本行业对制品干燥的首选方法。冻干在低温下进行，能最大限度保护蛋白、激素等制品中的活性成分，制品冻干后可除去97％以上的水分，且可保持制品原来的形状易于使用时复溶。

虽然冻干技术有着上述诸多优点，但仍存在需要解决的问题。冻干技术因其独特的生产工艺条件，为许多不稳定的大分子药物提供了一个稳定的制备环境，但是其是一个非常复杂的物理化学变化过程，可产生许多冰晶，制品在冻干后会出现分层、萎缩和脱壁等情况。因此，如何避免冻干过程中出现的上述状况成为了目前亟需解决的技术问题。

同时，高活性、高纯度的rhTNK-tPA冻干制剂一直是业内的追求。这一步需要在分离纯化阶段时最大程度地除去杂蛋白、内毒素等杂质，同时又要保证目标蛋白的活性不受到影响。而经目前的分离纯化方法得到的的目标蛋白比活性可达到50万IU/mg上，目标蛋白占总蛋白含量的98％以上，单体纯度大于95％，但是目标蛋白的活性回收率较低。

发明内容

本发明旨在提供一种注射用rhTNK-tPA冻干制剂及其制备方法，该方法能够获得外观良好、均匀、残余水分含量合格，高活性、高纯度能够长期保存的冻干制品。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种注射用rhTNK-tPA冻干制剂的制备方法，包括分离纯化、配液、除菌过滤、灌装与半加塞、冻干步骤。

(一)分离纯化

本发明提供了2种分离纯化方案，其中一种为：取细胞培养收获液过滤后经BlueSepharose 6Fast Flow亲和层析，用洗脱液Ⅰ洗脱、洗脱后进行赖氨酸亲和层析，用洗脱液Ⅱ洗脱，进行Capto Q阴离子层析后用洗脱液Ⅳ洗脱，最后经Sephadex G-25凝胶过滤层析，用洗脱液Ⅲ洗脱后得到纯化后的rhTNK-tPA。该纯化方法纯化后得到的目标蛋白比活性和纯度均较理想，比活性可到达50万IU/mg，目标蛋白占总蛋白含量的98％，但是活性回收率不太理想，仅有85％左右。

为此，本发明还提供了另一种纯化方案，其与第一种纯化方案的区别仅在于，改变了Sephadex G-25凝胶过滤层析的顺序，具体为，先用Blue Sepharos e 6FastFlow亲和层析，用洗脱液Ⅰ洗脱后进行Sephadex G-25凝胶过滤层析，然后再经赖氨酸亲和层析和CaptoQ阴离子层析得到纯化后的rhTNK-tPA。经反复试验验证显示，该纯化方法取得了意料不到的技术效果，其与第一种纯化方案得到的目标蛋白相比，比活性和纯度相当，但是回收率有了大幅度的提升(从85％提升至96％左右)。可能是由于，原缓冲液(P.B.+NaCl+Urea)中的某些成分会降低赖氨酸对目标蛋白的亲和作用，而先用Sephadex G-25凝胶过滤层析置换缓冲液，会降低这种作用，从而使得目标蛋白的回收率有所提高。

其中，本发明所述“洗脱液Ⅰ”由以下浓度的组分组成：20～100mM磷酸盐缓冲液、1～2M氯化钠溶液、2～5M尿素和0.04％聚山梨酯80，洗脱液的pH值为7.0～9.0，用量为2.0～4.0倍体积。