[发明专利]鹿胎多重PCR-RFLP-CE DNA指纹图谱及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种涉及中药材鹿胎的鉴定方法，具体是采用多重PCR（多重聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合CE（毛细管电泳技术）建立鹿胎DNA指纹图谱及鉴定方法。具有分辨率高、灵敏度高、高稳定性、操作简便、快速、成本低、易实现自动化分析等特点，能够应用于中药材鹿胎样品的真伪鉴定。

技术领域

本发明涉及中药材鉴定技术，具体是采用多重PCR（多重聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合CE（毛细管电泳技术）建立鹿胎DNA指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

鹿胎属我国名贵中药材,性温，味甘咸，归肾经，属高级滋养补品。临床上用于调经散寒、补气溢血、美容养颜等。由于鹿胎成分复杂，没有明确的功效成分，很难对鹿胎及其伪品作出准确判断。且正品鹿胎价格高昂，不法商贩在利益驱使下以假充真、以次充好，导致鹿胎中药材市场混乱。

长久以来，鹿胎鉴定一直采用四大传统鉴定方法（基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定），这些方法的鉴定标识在生物学上均属于物种的表型鉴定，易受生长环境、发育阶段、采收季节、加工炮制等因素影响，具有很大的变异性和可塑性（即可伪造性），并且这些方法还存在主观性强（鉴定者的经验、理化鉴定标识成分选择是否合理等）、重复性和稳定性差等缺点，鉴定结果客观性和可靠性较差。例如：传统鉴别法是通过正伪品性状差异进行鉴别，简单易行，但主观性强，其准确度取决于鉴定者的经验，故分辨率较低；红外光谱法主要优点是不破坏样品、所提供的信息量大，而在图谱分析方面要求实验人员有较为丰富的经验；高效液相色谱法检测灵敏度较高，但分析成本以及仪器的日常维护费用都很高。因此，为鹿胎提供一种简单方便、准确精准的方法迫在眉睫。

DNA指纹鉴定是利用生物体内遗传信息载体（DNA）对物种进行鉴别的方法，在分子水平上检测被鉴定对象的遗传标记特征，具有高度的种质特异性，比传统方法更科学、客观和准确。《中国药典》（2010年版）中采用DNA指纹鉴定技术鉴别蕲蛇、鹿胎，更说明了DNA指纹鉴定技术可以作为中药材鉴定的法定依据。

线粒体是具有半自主性的细胞器，是细胞进行呼吸活动、产生能量的重要场所。mtDNA 系母系遗传，基因组结构高度保守，一级结构有很大的差异，有利于进行种内和种间的遗传变异和进化研究。开展mtDNA酶切、毛细管电泳图谱的研究，可以为线粒体基因定位、建立基因文库、比较不同来源mtDNA的差异、探索物种的起源和演化以及地理分布等提供非常有意义的资料，且关于鹿胎的mtDNA序列未见报道。Cytb位于线粒体内膜磷脂双层中，是参与氧化磷酸化合成ATP过程电子传递链中的重要物质，是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白。其基因进化速度适中，近年来被广泛应用于两栖类、鱼类等的系统发育、种类鉴别等的研究。

而DNA指纹图谱是对各种药材，尤其中药易混品种通过基因组序列分析，寻找其保守且特异的指纹区段，设计引物进行特异性扩增，从分子水平上对中药材进行鉴定及分析。本发明采用多重PCR（聚合酶链式反应）、RFLP（限制性片段长度多态性分析）结合毛细管电泳技术进行鹿胎DNA指纹图谱的建立。

近些年来，毛细管电泳技术越来越被人们所熟知，其优点为：（1）高效（塔板数目在105-106 片/m 间，当采用CGE 时，塔板数目可达107 片/m 以上）；（2）快速（一般在十几分钟内完成分离）；（3）微量（进样所需的样品体积为nL 级）；（4）多模式（根据需要选用不同的分离模式且仅需一台仪器即可）；（5）经济（实验消耗不过几毫升缓冲溶液，维持费用很低）；（6） 自动（是目前自动化程度较高的分离方法）。

将荧光定量PCR结合毛细管电泳技术联合建立DNA指纹图谱与鉴定方法，无疑是强有力的方式。

发明内容

本发明的目的是提供一种多重PCR技术、RFLP技术结合毛细管电泳技术DNA指纹图谱及鉴定方法，以解决现有技术的缺陷。本方法分辨率高、灵敏度高、操作简便、快速、安全、结果准确，能够用于鹿胎样品的鉴定。