[发明专利]一种HBV DNA定量检测方法

说明书

本申请公开一种HBV DNA定量检测方法，包括：步骤一：样本处理；步骤二：准备反应管；步骤三：在反应管上做好标记，分别加已提取的待测样品、阴性质控品、缺失质控品，低速离心数秒；步骤四：对步骤三得到的样本进行PCR扩增；步骤五：放入43℃水浴摇床或杂交箱杂交1.5小时至4小时；然后取玻璃瓶并加入0.5×SSC液，拧紧盖子，一并置于43℃水浴摇床或杂交箱中预热；用A液室温轻摇洗膜；再用C液室温轻摇洗膜，同时配制显色液；将膜条浸泡于显色液中显色10‑15分钟即可观察并并根据膜条上的杂交斑点判断突变位点；具有适应性广和特异性高的优点；检测灵敏度更高、特异性及准确性更好。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体是指一种HBV DNA定量检测方法。

背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种疾病，主要通过血和 血制品、母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病毒感染者临床表现多样化，潜 伏期较长，最常见的临床表现有食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、乏力等症状， 部分患者有低热等症状。乙型肝炎患者可发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝 癌。

HBV-DNA常规检测方法主要有斑点杂交法和荧光定量PCR法。斑点杂 交法是较传统的方法，成本较低，灵敏度以及精准度都较低，假阳性几率较 高，不适合做HBV定量检测。

荧光定量PCR法是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体 的核酸定量检测技术。荧光定量PCR使用了特异性的探针，能够对靶序列进 行特异性的识别，具有引物探针双重控制，且综合了荧光标记技术、激光检 测技术、数码显像技术，在扩增指数期进行定量，具有很高的特异性、灵敏 性，准确性及假阳性率低等特点。

国内外临床应用HBV-DNA荧光定量PCR法存在以下缺陷：

1.常用的核酸提取方法有：a、磁珠法；b、层析柱法；c、碱裂解法,以上 三种方法需要繁琐的离心、换管等步骤，易导致核酸污染与丢失，且操作过 程繁杂，操作人员易疲劳操作。

2.PCR反应体系：传统的PCR反应体系多为无色，容易导致视觉疲劳。

因此，如何研发一种HBV DNA定量检测方法，能够解决上述问题，便 成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本申请解决的主要问题是提供一种HBV DNA定量检测方法，操作简单、 流程科学，标准明确，实践操作效果好，敏感性高、特异性很好、反应快速、 成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展，从而实现对HBV病毒的快速、 有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。以解 决一种HBV DNA定量检测方法成本高、流程不科学，标准不明确，实践操 作效果不佳、操作难度高、难以复制操作等技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种HBV DNA定量检测方法， 其技术方案如下：

一种HBV DNA定量检测方法，其特征在于，包括：

步骤一：相关试剂配制；

步骤二：取0.6m1离心管N个，N＝阴性对照+高值质控品+低值质控品 样本数量，分别编号；加入100ul样品处理液A到0.6ml离心管中；取待测 样本、阴阳性对照品及质控品各100ul,分别加到0.6ml离心管中，加入25u1 样品处理液B,振荡混匀,100℃干浴10min,振荡混匀,13000rpm离心10min(离 心时注意固定离心管方向，吸弃上清，13000r pm离心3min,取出震荡混匀后 再13000r pm离心5min,保留上清备用；

步骤三：若样本及对照品裂解产物保存在-20℃,使用前置室温解冻,以 13000rpm离心5min向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参 控品各2ul,盖紧PCR反应管管盖,并编至扩增和产物分析区；

步骤四：对所述步骤三得到的样本进行PCR扩增；