[发明专利]检测端粒长度的方法

说明书

本公开涉及一种检测端粒长度的方法，该方法包括以下步骤：S1.对待测细胞样本进行预处理，得到待测细胞样本的M期染色体悬液；S2.将所述染色体悬液离心并去除上清，得到含有M期染色体的第一沉淀，将所述第一沉淀与含有端粒特异肽核酸荧光探针的杂交液混合，进行变性并杂交，得到含有杂交染色体的悬浮液；S3.将所述杂交染色体悬浮液进行洗涤、离心并去除上清，得到含有杂交染色体的第二沉淀，将所述第二沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液；S4.使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中的染色体的荧光信号在单颗粒水平进行逐一检测。该方法能够实现对单染色体水平的人类端粒长度及短端粒比率的快速、精确、定量检测。

技术领域

本公开涉及一种检测端粒长度的方法。

背景技术

2009年的诺贝尔生理学或医学奖被授予伊丽莎白·布莱克本、卡罗尔·格雷德和杰克·绍斯塔克三位学者，以表彰他们发现端粒的特殊结构、端粒的染色体保护功能和端粒酶及其作用机制。

端粒是真核细胞染色体末端由重复性的DNA序列和特殊的端粒结合蛋白所组成的一段特殊结构，其中脊椎动物的端粒由富含G的短双链重复序列 TTAGGG串联组成。端粒能够防止染色体末端的降解、融合和重排，从而维持染色体的独立性、完整性和稳定性。虽然端粒不具备编码功能，却被科学家称为“生命的时钟”，因为端粒的长度和稳定性控制着细胞的寿命，并与细胞的癌变和衰老密切相关。

在正常人类体细胞中，端粒的长度会随着细胞分裂而逐渐缩短，细胞每分裂一次，端粒长度缩短一截，损失20～30个核苷酸，当端粒缩短到一定程度时，会诱导核蛋白结构的缺失，触发复制性衰老，出现细胞增殖减慢、生长停滞、干性减退、丧失分化能力等现象。同时，缩短的端粒上某些端粒特殊结合蛋白的丢失还会导致细胞将端粒末端错误识别为DNA断裂位点，从而启动DNA修复功能，导致短端粒染色体之间的末端融合，染色体的融合会造成细胞有丝分裂异常，细胞周期停滞，进而引发由p53蛋白诱导的细胞凋亡。此外，p53等基因突变导致细胞周期检测点缺陷的细胞会跃过复制性衰老，持续分裂最终进入危机期，这个时期极少数细胞表达端粒酶，激活端粒酶活性，修复并维持细胞端粒长度，使得细胞永生化为癌细胞。在诸如直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等90％癌细胞中发现端粒过度缩短和端粒酶活性。端粒异常导致的疾病还包括白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常和先天性角化不良等。端粒在人类的衰老与疾病的发生进程中扮演着极其重要的角色，端粒重复序列的长度变化决定着细胞的命运，因此端粒长度检测是端粒生物学研究中的重要实验方法。此外，端粒长度检测在衰老疾病和肿瘤中也具有重要的诊断价值。由于种属差异，人类染色体的端粒长度(双链区长度一般在0.5～20kb)远小于大多数实验室模型生物；且不同个体不同细胞中的端粒缩短程度不一样，细胞内不同染色体的端粒缩短程度也不一样；而长度小于等于3kb的端粒被定义为短端粒，最短的端粒而非平均端粒长度在端粒功能丧失，诱发DNA损伤和限制细胞存活中扮演重要角色。因此，亟需一种能够在单个染色体水平精确、简单、快速、高通量地检测人类端粒长度和短端粒比率的方法。

目前，端粒长度的代表性检测方法包括：末端限制性片段分析(terminalrestriction fragment,TRF)，定量PCR(qPCR)，单链端粒长度分析(single telomerelength analysis,STELA)，定量荧光原位杂交(quantitative fluorescence in situhybridization,Q-FISH)，流式荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization andflow cytometry,Flow-FISH)等。