[发明专利]肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针及制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及肺癌相关基因快速检测技术领域。本发明所获得的非小细胞肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，我们设计的探针不含有重复序列，避免非特异性交叉反应，具有准确性高，特异性好及假阳性低的优点。利用本发明所述的快速荧光原位杂交液，将杂交时间由原来的16h缩短到2h，大大提高了诊断效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及肺癌相关基因快速检测技术领域。

背景技术

随着现代医学的发展以及治疗理念的更新，肿瘤的治疗已经由传统的手术以及放化疗逐渐向个性化的分子靶标治疗转变，而寻找一个特异并且有效的治疗靶点，是当前肿瘤治疗研究的热点之一。棘皮动物微管相关样蛋白4（Echinoderm microtubuleassociated protein-like4.EML4与渐变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma Kinase,ALK）融合基因是非小细胞肺癌（NSCLC）中继表皮生长因子受体（EGFR）突变，Kras（ras 基因家族中的一种）突变后的又一特异性肿瘤驱动基因的分子靶向位点。EML4和ALK基因均定为于2号染色体的短臂，分别位于P21带和P23带，由于两者的分布方向相反，故发生融合时，其中一者需要从染色体上断裂，从而调转方向，与另一者发生融合。由于EML4断裂位点多变，所以与ALK发生融合可以形成多种不同的亚型。目前已经发现的EML4-ALK融合基因亚型至少有11种，其中部分亚型与肿瘤的发生密切相关。这些融合位点包括EML4编码蛋白质N端的基因片段和ALK激酶，激活下游信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、分化、抗凋亡。到目前为止除EML4基因外，已知还有TGF、KIF5B等多种基因可与ALK基因发生融合，启动ALK基因的表达，从而驱动致癌。靶向药物克唑替尼可以通过抑制ALK基因从而发挥遏制肿瘤生长的作用，是第一个针对渐变性淋巴瘤激酶（ALK）进行靶向治疗的药物，用于治疗通过FDA批准的检测方法诊断为ALK阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者。2011年8月美国食品药品管理局（FDA）批准克唑替尼用于临床治疗NSCLC.

荧光原位杂交技术是基于放射性原位杂交的一种非放射性分子细胞遗传技术，荧光标记取代了同位素。因为ALK 基因重排包括大的染色体片段插入和易位，所以选择荧光原位杂交方法来检测所有类型的ALK基因重排。该方法可以通过探针特异性标记细胞核中的ALK断裂点来检测ALK重排，进而鉴别出EML4-ALK。相对于THC和RT-PCR,FISH具有高敏感性和高特异性的优势。目前FISH是美国食品和药物管理局唯一批准的在应用克唑替尼前检测ALK基因的重排的方法，是检测EML4-ALK融合基因的金标准.

目前市场上已有的肺癌ALK基因重排的检测试剂盒，但是需要杂交试剂过长，通常在16h以上，影响诊断效率。

发明内容

本发明提供一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针的制备方法及一种快速荧光原位杂交液的配方。通过所述探针制备方法得到两组荧光探针分别位于ALK基因的3’端的两侧，而此位置是ALK基因重排发生的活性位点，不仅能够与TGF,EML4,KIF5B等多种基因发生重排。而且也能够预测和检测尚未知的其他与ALK基因发生重排的基因，从而影响ALK基因的表达引发的致癌检测。该方法，配方操作简单，特异性和灵敏性高，可以快速，准确地检测出肺癌融合基因，检测结果准确且可靠，同时可以为医生对肺癌进行分子分型提供参考依据，适用于大规模推广应用.

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，其特征在于，所述荧光探针是双色分离探针，两组荧光探针分别位于ALK基因的3’的两端.

如权利要求1所诉一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，其特征在于，所述荧光为红，绿两种探针，ALK基因位于2号染色体短臂2区3带的位置，其基因长度为728.838Kb，采用ALK基因3’端上游300Kb基因红色荧光标记，ALK基因3’端下游420Kb采用绿色荧光标记.