[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素‑6的基因工程细胞株。本发明首先提供了特异性靶向小鼠ROSA26基因的sgRNA，其靶序列如SEQ ID NO.1所示，进而构建能同时表达所述sgRNA和Cas9蛋白的定点切割载体；本发明还构建了含有小鼠白细胞介素‑6和ROSA26基因同源序列的donor载体，在小鼠细胞SP2/0的ROSA26位点定点整合小鼠白细胞介素‑6，并通过筛选标记筛选获得纯合细胞系，获得高表达小鼠白细胞介素‑6的基因工程细胞株，本发明的细胞株可用于生产具有高比例分泌能力的杂交瘤细胞，在单克隆抗体制备领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株。

背景技术

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，包括噬菌体和外源质粒，致使目的基因功能的缺失或部分缺失。CRISPR/Cas系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效，是近两年来新发现并广泛用于基础研究的基因编辑新技术。CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物能够引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人为设计,可以将crRNA和tracrRNA改造，形成具有引导作用的单个RNA，即sgRNA(single guide RNA)。实验证明，sgRNA足以引导Cas9对DNA的定点切割。

CRISPR/Cas是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行精确编辑。如果将含有Cas9蛋白编码基因的质粒和sgRNA表达质粒一同转入细胞中，sgRNA可以靶向目标序列，Cas9蛋白则会使相应的DNA双链发生断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子，即donor载体)，细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段或定点突变，这样就可以实现基因的替换或者突变。

ROSA26位点位于小鼠基因组第6号染色体，该位点转入的基因能正常稳定表达，是小鼠细胞中最常使用的定点整合位点。特异靶向ROSA26位点的CRISPR/Cas9体系能在小鼠第6号染色体上的ROSA26位点上生成DNA双链断裂，触发细胞的DNA修复机制，诱导基因组与ROSA26供体质粒质检发生同源重组(HR)，将供体质粒上的DNA片段整合到基因组上的ROSA26位点。

单克隆抗体具有滴度高，特异性强，质地均一的特点，它不但大量用于基础研究，还用于临床诊断、体内显像定位、食品环境监测、体内治疗和导向治疗等领域。随着生物技术的发展，单克隆抗体在疾病诊断与治疗方面的作用越来越受到人们的重视。

目前，单克隆抗体通常是通过杂交瘤技术来制备的。但是，传统杂交瘤技术制备单克隆抗体是个复杂而费时的工作。需要经历抗原制备、动物免疫、骨髓瘤细胞及饲养细胞制备、细胞融合、融合细胞筛选、阳性杂交瘤细胞株筛选与克隆化等一系列流程，平均六个月才能开发一种或几种单克隆抗体，而且成功率低、成本高，限制了抗体产业的发展。提高制备单克隆抗体效率的一个可供参考的改进方向是怎样获得高比例的能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞？