[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株在审
| 申请号： | 201810467123.4 | 申请日： | 2018-05-16 |
| 公开（公告）号： | CN108624622A | 公开（公告）日： | 2018-10-09 |
| 发明（设计）人： | 艾立平;蒋明贵 | 申请（专利权）人： | 湖南艾佳生物科技股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12N5/10;C12N15/06;C12P21/08 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;陈征 |
| 地址： | 410013 湖南省*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 小鼠 白细胞介素 基因工程细胞株 分泌 系统构建 构建 基因同源序列 单克隆抗体 特异性靶向 杂交瘤细胞 定点整合 筛选标记 小鼠细胞 靶序列 高表达 细胞株 纯合 可用 位点 制备 切割 蛋白 筛选 基因 应用 生产 | ||
1.一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建能同时表达sgRNA和Cas9蛋白的定点切割载体；
(2)构建了含有小鼠白细胞介素-6基因和ROSA26基因同源序列的donor载体；
(3)将定点切割载体和donor载体转入小鼠细胞SP2/0骨髓瘤细胞，筛选阳性克隆，鉴定即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为5`-CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT-3`。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述定点切割载体含有筛选标记，优选筛选标记为荧光标记。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述donor载体中，小鼠白细胞介素-6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述donor载体中，ROSA26基因同源序列的同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，同源右臂的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
6.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，所述donor载体还含有抗生素筛选标记，优选所述抗生素筛选标记为嘌呤霉素抗性基因。
7.权利要求1-6任一所述制备方法在制备白细胞介素6表达量提高的细胞中的应用。
8.权利要求1-6任一所述制备方法构建得到的基因工程细胞株。
9.权利要求7所述的基因工程细胞株在制备单抗分泌量高的杂交瘤细胞中的应用。
10.权利要求7所述的基因工程细胞株在制备单克隆抗体中的应用。
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