[发明专利]一种Atg5瞬时沉默载体

说明书

本发明利用RNA沉默途径沉默靶基因的原理，通过将Atg5基因的两个特异性沉默片段SL和SS连接至双元表达载体pCV1300，农杆菌瞬时表达构建了一种Atg5瞬时沉默载体，即siatg5沉默载体。通过定量以及利用GFP‑Atg8f分析表明，siatg5能导致Atg5基因沉默，有效抑制自噬途径，缓解不同细胞器定位的蛋白的降解，从而促进细胞器外源蛋白的积累。本发明表明siatg5沉默的自噬途径涉及内质网、质体、线粒体、过氧化物酶体等绝大多数细胞场所，siatg5沉默载体可能对植物细胞中的多种场所、细胞器的自噬途径具有调节作用。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种自噬途径关键基因Atg5的瞬时沉默载体。该沉默载体能够导致Atg5基因沉默，抑制自噬途径，缓解不同细胞器定位的蛋白的降解，从而促进外源蛋白的积累。

背景技术

利用基因重组技术，通过将生物体作为生物反应器来表达和生产外源蛋白是当前生物技术研究的热点问题。常用的外源蛋白表达系统主要有原核表达、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统等，不同的表达系统具有不同的表达特征。与其他表达系统相比，植物表达系统具有以下优点：(1)植物作为真核生物，具有真核蛋白的修饰机制，能够进行蛋白折叠、翻译后修饰，从而表达高生物活性的目的蛋白；(2)没有哺乳动物病原的污染，几乎不受病原菌感染，产品具有较高的安全性；(3)植物的生产成本低廉，其总体生产成本大概为微生物的2％-10％，为动物的0.1％；(4)植物表达产品的分离纯化成本相对较低，适用于大规模生产；(5)便于外源蛋白贮存，外源蛋白可以贮存在种子、果实等部位。因此，以植物表达系统作为生物反应器来表达外源蛋白越来越引起国内外研究者的重视。植物表达系统常用于具有重要经济价值的药用蛋白或疫苗的制备，目前已利用普通烟、本氏烟、水稻细胞等细胞或植株成功表达了鼠IgG1抗体、hGM-CSF、人类VEGF等，产生了较高的经济价值。然而植物表达系统仍然存在目标蛋白表达量低下的问题，该问题是制约植物表达系统产业化的主要因素之一。

自噬途径(Autophagy)是普遍存在于生物体内的重要蛋白降解途径，主要通过细胞内双层膜凹陷形成囊泡结构后，与溶酶体(lysosome)融合成为自噬溶酶体(autolyosomes)执行降解功能。在胁迫条件下，通过自噬途径可以将一些胞质内容物包括多余或者受损的蛋白质和细胞器送入液泡中进行降解，并加以循环利用，从而维持细胞内稳态，并帮助生命体抵抗外界胁迫环境。根据形成自噬体的方式不同可以将自噬分为三类：巨自噬(Macroautophagy)、微自噬(Microautophagy)和伴侣参与的自噬(Chaperone-mediated autophagy)，而在植物中只发现巨自噬和微自噬。

植物中，多种自噬相关基因(autophagy-related genes,ATG)参与自噬途径，植物中自噬途径涉及30多个蛋白，其中,Atg5是参与自噬途径的重要基因，在植物体内仅发现一个，它参与Atg8介导的泛素化系统，是自噬途径的重要调节基因。自噬途径检测研究表明，Atg8被Atg4、Atg3、Atg7等切割修饰后，形成成熟的Atg8后与Atg5-Atg12-Atg16复合体协作，最终形成自噬囊泡。在这个过程中，Atg5通过与Atg12、Atg16L1互作形成复合体，附着在未成熟的自噬体外膜上指导自噬体的成熟，由此可见，沉默Atg5可以抑制自噬途径。

目前，针对某个已知的基因，设计可诱导其沉默的siRNA，通过合适的手段导入细胞或机体，使该基因表达水平下降或完全沉默，是RNA干扰技术最广泛的应用。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种Atg5瞬时沉默载体，即siatg5沉默载体，该载体可以特异沉默Atg5而不能对其它基因造成沉默，为深入研究该基因单独的功能提供可能性。另外，选在不同位置的片段进行沉默，发现可以实现精确定位细胞器的沉默片段，为揭示Atg5基因在细胞器水平上的作用机理提供了可能。