[发明专利]基于微流控芯片检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道合胞病毒A、B型的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针。本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道合胞病毒A、B型进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道合胞病毒A、B型的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测呼吸道合胞病毒A、B型的试剂盒及其使用方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是一种单链RNA病毒，属于副粘液病毒科，是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一。由于RSV在细胞中可以引起细胞融合病变，根据它在细胞培养中的细胞病变特征命名为呼吸道合胞病毒。

RSV最显著的特征是每一次RSV感染只能调节以后感染的严重程度，产生的抗体并不能对机体产生永久性保护，因此RSV可反复感染。母传抗体也不能预防感染的发生，因而出生不久的小婴儿即可发病，常引起小儿间质性肺炎及毛细支气管炎，是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原体。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为毛细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为呼吸道感染。潜伏期3～7天，RSV感染有明显的季节性，主要暴发流行于冬春季节，每年的11月～次年2月为暴发流行的高峰季节。

呼吸道合胞病毒是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成的，其基因组编码10种蛋白质，包括7种结构蛋白(G、F、M1、M2、P、L、N)和3种非结构蛋白(NS1、NS2、SH)，其中G蛋白和F蛋白位于病毒颗粒的表面，是主要的糖蛋白。RSV根据抗原性的不同可分为A、B两亚型，两亚型间的主要区别在于G蛋白的基因差异，G蛋白是RSV毒株中变异最大的蛋白，仅存在5％的抗原相关性。有文献报道，A亚型呼吸道合胞病毒相较于B亚型，具有更强的致病性，婴幼儿感染后，B亚型比A亚型对同型G蛋白的抗原反应更强烈且有效。

我国每隔数年会出现由呼吸道合胞病毒感染导致的流行性喘憋型肺炎，常造成数十万人发病，不同年份A、B亚型可以交替成为流行优势株。RSVA、RSVB亚型患儿均以咳嗽、喘息为主要症状，其次为鼻塞流涕、发热、呼吸困难，两亚型临床表现无明显差异。利用分子技术可以快速、准确地进行分型，避免误用或者滥用碱性药物，对呼吸道感染早期诊断以及正确治疗的意义十分重大。

目前市场上针对呼吸道合胞病毒的检测方法主要有病毒培养法、免疫检测法和荧光PCR法。培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白。荧光PCR法是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因。

微流控芯片(microfluidics)或称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反应，分离、检测等基本操作单元或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。这种技术原则上适用于从核酸、蛋白质直到有机、无机小分子的各种不同类型分子的反应、分离和检测。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点,它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。