[发明专利]GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用

说明书

本发明公开了GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。具体是苹果酸脱氢酶基因GmMDH12控制根瘤苹果酸合成及其在促进豆科作物根系结瘤方面的应用。本发明研究发现，GmMDH12具有调控大豆根瘤苹果酸合成的功能，超量表达GmMDH12显著增加了大豆转基因复合植株根瘤内源苹果酸浓度，增加了根瘤数和根瘤生物量，从而提高了植株氮含量和生物量。依据本发明，GmMDH12基因具有通过转基因技术提高豆科作物生物固氮功能的潜力，对提高作物养分高效利用以及环境友好型可持续农业的发展具有重要的理论和实践意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。更具体地，涉及GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用。

背景技术

豆科植物根系能够和根瘤菌形成互利互补的共生系统--根瘤。宿主植物能够为根瘤菌的生长提供碳源和合适的生长环境，而根瘤菌则通过固氮酶的作用进行生物固氮，为宿主生长提供氮源。将根瘤菌接种技术应用于农业生产，改善作物氮营养，是豆科作物节肥增产的有效措施，在农业生产中发挥着重要的作用 (Qin et al., 2012)。豆科植物根瘤菌的生长、根瘤的形成以及生物固氮是一个复杂的生理生化过程，由许多代谢途径共同参与完成，其中包括碳代谢途径 (Hernández et al., 2009)。大豆 [Glycine max (L.) Merr]是全世界范围内一种重要的油料和蛋白质作物，是食用油和食用蛋白的重要原料，也是我国最重要的豆科作物。大豆能够和根瘤菌互利共生形成根瘤，可以改善大豆的氮营养，降低氮肥投入。

在根瘤碳代谢过程中，磷酸烯醇丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate, PEP) 是一个重要的中间代谢产物。在根瘤中，PEP主要通过两个途径被同化，一个是合成有机酸进入根瘤的三羧酸循环途径，另一个则是进入氮同化的氨基酸代谢途径 (White et al., 2007)。研究认为，在根瘤菌中，碳代谢的主要方向是经PEP生成草酰乙酸 (Oxaloacetate, OAA)，最后合成苹果酸的途径 (Le Roux et al., 2008)。通过¹⁴C标记试验，发现在根瘤中的苹果酸具有标记信号，暗示苹果酸可能作为碳代谢的产物在根瘤中积累，苹果酸被认为是根瘤菌呼吸代谢过程中的重要碳源，进一步被用于根瘤菌的代谢消耗 (Rosendahl et al.,1990; Le Roux et al., 2006)。

苹果酸脱氢酶基因MDH (EC.1.1.1.37) 能催化苹果酸与OAA的可逆转化，是三羧酸循环途径中的关键酶。在苜蓿、豌豆和菜豆等豆科作物中，发现接种根瘤菌可以显著提高MDH酶活性，而根瘤中MDH酶活性的增加被认为主要作用于调控根瘤碳代谢途径中苹果酸的合成 (Miller et al., 1998; Colebatch et al., 2002; Le Roux et al., 2008; Hernández et al., 2009)。并且，大量研究也表明，超量表达MDH基因，能够增加苜蓿，大豆和烟草等植株内源苹果酸的含量 (Tesfaye et al., 2001; Lü et al., 2012)。但是，调控根瘤苹果酸合成的重要基因，以及增加苹果酸的合成是否能够促进根系结瘤、提高豆科作物的氮营养仍不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过蛋白质组学和定量PCR等分析方法，在大豆根瘤中同源克隆了一个GmMDH12基因（序列如SEQ ID NO.3所示，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示），发现其在蛋白及转录水平上同时受到低磷增强表达，证明了GmMDH12基因编码的蛋白具有促进根瘤苹果酸合成的生物学功能，进而促进了根系结瘤，并最终提高了转基因材料根瘤固氮能力及生物量。