[发明专利]一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的芽胞杆菌的制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术及发酵领域，具体公开了一种通过过表达phoP基因高产聚γ‑谷氨酸的芽胞杆菌的制备方法及应用。本发明以质粒pHY300PLK为表达载体，在地衣芽胞杆菌WX‑02中游离表达磷代谢转录因子基因phoP，构建了地衣芽胞杆菌工程菌WX‑02/pHY300‑phoP，与转入pHY300PLK空质粒的对照菌WX‑02/pHY300相比，工程菌株的γ‑PGA的产量提高了30%以上。本发明首次尝试通过强化phoP基因的表达，提高了γ‑聚谷氨酸的产量，为今后γ‑PGA的发酵生产提供了新思路。

技术领域

本发明属于生物技术及发酵领域，具体涉及一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的芽胞杆菌的制备方法及应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸(Poly glutamic acid,γ-PGA)是由D-谷氨酸和(或)L-谷氨酸单体经γ-酰胺键聚合而成的一种多功能生物高分子聚合物，其具有良好的水溶性，保水性，金属阳离子螯合，无毒性和可生物降解性等特性，目前已被应用于化妆品，医药，食品，水处理和农业等产业中，如作为材料和药物载体，食品防腐剂，金属离子螯合剂和高度吸水性水凝胶等。

枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌中，聚谷氨酸是由ATP依赖的聚谷氨酸合酶复合体pgsB CA合成的。在枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌中，有多种调控因子来直接或间接的调控该复合体。

PhoP-R双组分信号转导系统控制由枯草芽胞杆菌激活的三种反应以适应磷酸盐限制条件，这种反应包括酶和转运蛋白的产生，它们在环境中清除磷酸盐，并将其同化到细胞中，其中PhoP对PhoR其正调控作用。在地衣芽胞杆菌中同样存在双组分信号转导系统PhoP-R，那么PhoP对聚γ-谷氨酸的合成是否存在直接调控或者间接调控并没有相关的报道。本发明首次尝试在地衣芽胞杆菌中过表达phoP基因，发现过表达phoP后聚γ-谷氨酸产量大幅度提高。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法，该方法通过在地衣芽胞杆菌中强化表达phoP基因，从而大大提高了聚γ-谷氨酸产量。

本发明的另一个目的在于提供了一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法的应用。利用本发明的方法，可用于工业化制备聚γ-谷氨酸。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法，是利用本领域的常规方法将phoP基因的在地衣芽胞杆菌中强化表达。

以上所述的方法中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02；

以上所述的方法中，具体的，包括下述步骤：

(1)以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因片段；

(2)在phoP基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的phoP表达元件；

(3)采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

(4)准备质粒pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；

(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR得到阳性转化子，经过测序得到游离表达质粒pHY300-phoP；