[发明专利]一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的芽胞杆菌的制备方法及应用

权利要求书

1.一种通过过表达phoP基因高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法，包括将phoP基因在地衣芽胞杆菌中强化表达，所述的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02，所述phoP基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其步骤包括：

（1）以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出phoP基因片段；

（2）在phoP基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的phoP表达元件；

（3）采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（4）准备质粒pHY300PLK，并采用EcoRI和XbaI限制性内切酶对质粒 pHY300PLK进行双酶切得到线性质粒片段；

（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以氨苄青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR得到阳性转化子，经过测序得到游离表达质粒pHY300-phoP；

（6）将游离表达质粒pHY300-phoP电转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以四环素抗性作为筛选标记，并经过菌落PCR筛选得到阳性转化子，即得。

3.利用权利要求1所述的方法制备得到的地衣芽胞杆菌在生产聚γ-谷氨酸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述生产的过程中的发酵培养基配方：包括：30~90g/L葡萄糖或20~60g/L甘油，0~30g/L谷氨酸钠，0~10g/L柠檬酸钠，0~10g/L NaNO₃，0~10g/LNH₄Cl，0~1g/L K₂HPO₄·3H₂O，0~1g/L MgSO₄·7H₂O，0~1g/L ZnSO₄·7H₂O，0~0.15g/LMnSO₄·H₂O，0~1g/L CaCl₂，pH6.5~7.2；

所述的发酵的培养基中，其组分谷氨酸钠，柠檬酸钠， NaNO₃，NH₄Cl， K₂HPO₄·3H₂O，MgSO₄·7H₂O， ZnSO₄·7H₂O， MnSO₄·H₂O和CaCl₂中每次只能有一种组分取0。

5.根据权利要求3所述的应用，所述生产的过程中的发酵培养基配方：30~90g/L葡萄糖或20~60g/L甘油，15~30g/L谷氨酸钠，5~10g/L柠檬酸钠，5~10g/L NaNO₃，5~10g/L NH₄Cl，0.5~1g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.5~1g/L MgSO₄·7H₂O，0.5~1g/L ZnSO₄·7H₂O，0.075~0.15g/LMnSO₄·H₂O，0.5~1g/L CaCl₂，pH6.5~7.2。