[发明专利]鸭性别鉴定用RT-PCR引物、试剂盒及鉴定方法

说明书

本发明涉及一种鸭性别鉴定用RT‑PCR引物，引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，另外本发明还提供了一种包含所述鸭性别鉴定用RT‑PCR引物的试剂盒和利用该试剂盒鉴定鸭性别的方法。本发明可以在RNA水平上进行鸭个体的性别鉴定，操作简单，鉴别快速，尤其对于珍稀cDNA样本的性别鉴定具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术领域，具体涉及一种鸭性别鉴定用PCR、鉴定方法及试剂盒。

背景技术

性别鉴定在家禽养殖业中有重要作用，通过鉴定1日龄雏鸭的雌雄，可淘汰非目的性别，降低饲养成本，提高经济效益。随着人们生活习惯和地域的差别，对不同性别肉鸭的需求有明显的不均衡性，而且雌雄对于环境、营养条件等的反应也不同，实现雌雄分群饲养，便于科学管理、提高生产性能和屠体品质，同时性别鉴定在基础研究领域更具有重要意义。

目前，鸭子性别的鉴定方法一般分为外形鉴别法、鸣管鉴别法、摸肛鉴别法和分子水平鉴定法。其中外形鉴别法根据公母鸭的体型外貌特征区别，常有误判；鸣管鉴别法需要鸭的鸣管发育好才能区别，在出壳至青年期很难区分；摸肛鉴别法虽然准确率较高，但是存在一些垂直传播病菌交叉感染的风险，且摸肛对技术要求比较高，需要生产实践经验丰富才能保证准确率。分子鉴定法是利用性染色体W和Z上特殊基因的片段大小不同而判定性别，家禽W染色体仅存在与雌性个体中，W染色体上存在很多保守序列，利用这些序列可以对家禽性别进行鉴定。位于鸭W染色体上的Wpkc i基因具有高度保守性，可以用于鸭性别鉴定。但是目前分子鉴定均集中于DNA水平，对于已经获得的一些单一或混合样本的cDNA，特别是珍贵样品，性别未知，但是性别对于后续的研究极为重要，无法通过cDNA鉴定其性别。有时候一些样本已经在DNA水平进行了性别鉴定，但在提取RNA及反转录为cDNA的过程中，可能会出现个别样本编号混淆导致性别不确定的问题，在cDNA水平上无法进行性别鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸭性别鉴定用RT-PCR引物、鉴定方法及试剂盒，可以在RNA水平进行鸭性别鉴定。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鸭性别鉴定用RT-PCR引物，包括上游引物DWL和下游引物DWR，其序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

其中SEQ ID NO:1的序列为ATGGCCGACGGGATTGTT

SEQ ID NO:2的序列为CTATTCGGCGGCGATAGT

一种鸭性别鉴定用试剂盒，包含所述鸭性别鉴定用PCR引物，还包括用于扩增β-actin内参基因的内参引物、TaqDNA聚合酶、buffer缓冲液和dNTP，所述内参引物包括上游引物actL和下游引物actR，其序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，其中

SEQ ID NO:3的序列为GCCATCTTTCTTGGGTAT

SEQ ID NO:4的序列为CTTGATTTTCATCGTGCT

一种鸭性别鉴定方法，该方法为：提取待测样品的总RNA，用所述鸭性别鉴定用RT-PCR引物、内参引物、TaqDNA聚合酶、buffer缓冲液和dNTP进行RT-PCR,然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物中出现363bp和255bp的特异性扩增条带时判定为雌性鸭，当扩增产物中没出现363bp和255bp的特异性扩增条带时判定为雄性鸭。所述待测样品包括但不限于鸭胸肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、睾丸、卵巢、血液组织。所述RT-PCR过程中，cDNA扩增的反应程序为：98℃预变性2分钟，98℃变性10秒，59℃复性30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸5分钟，所述363bp的特异性扩增条带的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

其中SEQ ID NO：5的序列为