[发明专利]一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的SSR引物及方法

权利要求书

1.一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于：所述引物包括引物CISSR09643的上游引物CISSR09643-F和下游引物CISSR09643-R，所述上游引物CISSR09643-F 的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物CISSR09643-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA；

（2）利用权利要求1所述的引物CISSR09643对提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增；

（3）对步骤(2)的PCR扩增产物进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

（4）对步骤(3)电泳检测结果进行分析，真正杂交种的标准图谱为同时具有两个亲本特异性序列的图谱，否则为假杂种，利用统计结果计算杂交种子纯度。

3.如权利要求2所述的一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：

所述步骤(1) 中提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA采用改良的CTAB法提取：①取新鲜叶片30mg放入2ml的离心管中，加入一个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中90s，然后利用组织研磨仪磨样；

② 在磨好的样中加入800µl 2%的CTAB提取液，55℃水浴20min；

③12000rpm离心1min，吸取600µl上清于干净的1.5ml的离心管中，加入300µl氯仿和异戊醇混合物，充分混匀；氯仿和异戊醇混合物中氯仿和异戊醇的体积比为24：1；

④ 13000rpm离心1min，取300µl上清于另一1.5ml的离心管中，加入550µl无水乙醇与乙酸铵，混匀，放-20℃冰箱1h；无水乙醇与乙酸铵提前在-20℃条件下预冷；

⑤ 12000rpm、离心10分钟，倒掉上清液，室温放置；

⑥ 待离心管中无酒精味时，加入100µl ddH2O溶解DNA；

所述步骤(2) 中PCR 扩增时采用的反应体系为：提取西瓜亲本或其杂交后代的基因组DNA 1μL，2*Taq MasterMix 7.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至15μL；

所述步骤(2) 中PCR 扩增时扩增程序为：94℃预变性3min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s， 55℃退火30s，72℃延伸30s；最后延伸2min，置于4℃保存；

所述步骤(3)中电泳检测时，银染法染色，白光下拍照记录特征条带。

4.根据权利要求2或3所述的一种用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于：用于西瓜品种博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度鉴定；

利用权利要求2或3所述的用于西瓜杂交种子纯度鉴定的方法鉴定博琳、安德、天福二号、黄凤凰杂交种子纯度的方法如下：

若西瓜品种博琳杂交种子中能扩增203bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.3 所示、以及227bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.4所示，则为真正杂交种，否则为假杂种；

若在西瓜品种安德杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.5所示、以及225bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.6所示，则为真正杂交种，否则为假杂种；

若在西瓜品种天福二号杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.7所示、以及225bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.8所示，则为真正杂交种，否则为假杂种；

若在西瓜品种黄凤凰杂交种子中能扩增201bp的母本特异性序列如SEQ ID NO.9所示、以及225bp的父本特异性序列如SEQ ID NO.10所示，则为真正杂交种，否则为假杂种。