[发明专利]一种食源性益生菌的特异性荧光标记方法及其体内应用

说明书

本发明涉及食源性益生菌的特异性荧光标记方法，包括以下步骤(a)通过溶剂热‑高温煅烧法，制备具备近红外荧光和超长余辉性质的Cr³⁺掺杂镓锗酸锌长余辉荧光纳米探针；(b)通过抗体表面功能化，实现纳米探针对于目标益生菌的特异性荧光标记。本发明的有益效果在于：(1)本发明所制备的镓锗酸锌长余辉纳米探针具有超强近红外发光和超长余辉寿命、优异的生物相容性和结构稳定性、良好的粒径均一度和低毒性。(2)本发明所开发的近红外荧光标记益生菌体内生物成像技术，可实现无损可视化地示踪益生菌体进入生物体后的分布状况，对于开辟创新型的食源性益生菌的功能位点及营养学研究理念具有重要意义。

技术领域

本发明属于食源性益生菌的研究领域，涉及食源性益生菌的特异性荧光标记方法及其体内应用。

背景技术

益生菌，是肠道微生物菌群的重要部分，当它摄入足够的数量时，会给消费者(宿主)健康带来极大的益处。益生菌可极大的促进人体肠道健康，调节人体的免疫应答。尽管对人体健康具有极大的益处和特殊的功能，但体内与益生菌相关的代谢，分布和免疫调节还尚不十分明确，对大多数新物种的功能和活性作用仍然不够明了，需要获取更多的信息进行评估。

目前现代分子生物学技术如聚合酶链反应与变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)，实时定量PCR，DNA微阵列，焦磷酸测序和高通量测序等各种方法确定生物样品的DNA序列，揭示益生菌的类型，分布和代谢。然而，上述技术通常需要收集大量样本(粪便或体内组织)，设计探针/引物、对大量的数据进行统计分析，耗时耗力。此外，这些方法不能够进行原位检测，几乎无法通过非破坏性和实时原位监测对生物体内益生菌分布状况进行真实再现。因此，亟需建立一种能够快速、直观且具有非破坏性的实时原位监测技术，为益生菌在体内的分布及功能位点探究提供技术支撑。

针对以上研究方法需求和领域空白，我们引入了荧光成像技术。荧光成像作为探索肿瘤早期诊断治疗的关键技术，是现今生物医学领域和现代分析科学中的前沿方法，尤其是采用无创成像和微创体内生物成像在活体水平上非侵入式监测肿瘤的发生发展，对于癌症的预防和早期诊疗具有重要的生命医学研究意义和临床应用价值。将这种无创成像技术应用到食源性微生物体内研究中，可以充分发挥荧光成像实时无损监测的优势，进而可以系统性的研究益生菌进入生物体后的分布状况和代谢行为。

荧光成像的影像效果依赖于造影剂(即荧光探针)的发光性能和靶向功能化。现代生物成像中的光学检测要求(1)荧光探针的工作区域为生物透过窗口(700-1000nm和1100-1350nm)的近红外光区工作以便增加检测光的深组织透过率；(2)荧光探针的激发光不宜采用紫外光和可见光，以避免组织的自体荧光；(3)荧光探针的激发光强度不宜太强，以便降低背景信号，增大成像的信噪比；(4)能够提供实时、整体、分布式的观测结果。荧光纳米探针不同于小分子成像造影剂或药物，它不仅可以克服常规临床肿瘤诊断技术存在的空间分辨率低、组织对比度低、准确性差、容易漏误诊等问题，还可以解决癌症治疗方法中化学疗法存在的血液循环时间短、治疗效率低、缺乏专一性、损害人体正常细胞等问题。近几年来基于不同的光物理化学性能，研究者逐渐提出了几种不同的荧光探针，包括：荧光编码蛋白、有机染料、半导体量子点、贵金属纳米粒子、碳纳米材料以及上转换发光材料。然而这些材料都在不同程度上有着各自的缺陷，例如信噪比差、缺乏光学稳定性、光漂白、相干光激发、发光强度不稳定等。