[发明专利]降低表达文库假阴性率的膜系统建库方案

说明书

本发明涉及降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案，包括增加用于反转录的起始总RNA量并分离mRNA进行反转录；增加文库接头的种类。本发明改变了建库过程中的反转录使用的RNA种类及接头种类，降低了膜体系表达文库的假阴性率。

技术领域

本发明涉及表达文库制备领域，具体涉及一种用于降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案。

背景技术

酵母双杂交(Yeasttwo hybrid)技术是由Fields和Song等最早建立的一种用于研究真核生物蛋白相互作用的一种技术，目前已被广泛应于蛋白质组学功能、基因组学及细胞信号转导等领域。该方法既可以用于检测已知蛋白之间的相互作用，也可以用来发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

酵母双杂交的技术原理主要是基于酵母转录因子GAL4的结构特点，GAL4是组件式的(modular)，由两个或两个以上的结构域组成，这两个结构域在结构上能够分开，功能上也是互相独立的结构域(domain)。两个结构域分别是DNA结合功能域(DNA bindingdomain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation doman，DNA-AD)。这两个结构域在分开时虽然仍然分别具有各自的功能，但是分开时由于空间上的距离导致两者不能共同作用从而不能激活转录，但是当两个结构域通过适当的途径在空间上较为接近时，就可以呈现完整的GAL4转录因子活性，从而能激活上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与编码诱饵蛋白(Bait protein)的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein；将编码DNA-AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上，同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞既不能产生GAL4，也不能合成LEU、TRP、HIS和ADE等成分，当将这种酵母培养在缺乏上述四种营养成分的培养基上时酵母无法生长。然而如果上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析，以便确定诱饵蛋白和靶蛋白是否存在相互作用。

最初该系统主要用于研究核蛋白的功能，后来经过改造，引入了分裂泛素技术，该技术是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。它的主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。已有的泛素分裂建库方案在连接接头时只提供一种读码框序列，cDNA序列连接进载体时可能会存在多种阅读框，因此可能会造成cDNA的阅读框错误从而造成假阴性率的提高。

因此，降低膜体系表达文库假阴性率是建库中亟待解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，提供了一种用于降低膜体系表达文库假阴性率的建库方案。方案如下：增加反转录时所使用的总RNA的量并分离mRNA用于反转录，增加建库接头的种类。

优选的，所述用于降低膜系统表达文库序列冗余度并提高建库效率的建库方案，包括如下具体步骤：

(1)总RNA分离mRNA；

(2)mRNA反转录成cDNA及cDNA的二链合成；

(3)对所得cDNA加接头；

(4)将连接好接头的cDNA进行分级分离；

(5)与pDONR222进行BP重组；