[发明专利]降低表达文库假阴性率的膜系统建库方案在审
| 申请号： | 201810375612.7 | 申请日： | 2018-04-24 |
| 公开（公告）号： | CN110396726A | 公开（公告）日： | 2019-11-01 |
| 发明（设计）人： | 王树伟;赵仕兰;肖云平 | 申请（专利权）人： | 上海欧易生物医学科技有限公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 201114 上海市闵行*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 表达文库 反转录 假阴性 建库 膜体系 分离mRNA 膜系统 总RNA 文库 | ||
1.用于降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案，其特征在于，增加用于反转录的起始总RNA量并分离mRNA进行反转录；增加文库接头的种类。
2.如权利要求1所述的降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案包含：
(1)总RNA分离mRNA；
(2)mRNA反转录成cDNA及cDNA的二链合成；
(3)对所得cDNA加接头；
(4)将连接好接头的cDNA进行分级分离；
(5)与pDONR222进行BP重组；
(6)对文库进行质检；
(7)合格文库制备初级文库质粒；
(8)次级文库制备。
3.如权利要求2所述的降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案，其特征在于(1)用于反转录的总RNA样本量需要用100-500微克，采用Oligotex mRNA Midi Kit方法分离mRNA，使用分离好的mRNA进行后续反转录实验。
4.如权利要求2所述的降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案，其特征在于(2)取1-5微克步骤(1)中分离的mRNA，加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer 1微升，dNTP微升混匀，70℃保温5分钟，降温到45℃孵育2分钟，再用SuperScript III反转录酶45℃保温20分钟，再依次加入E.coli.DNA Ligase、E.coli.DNA Polymerase I、E.coli.RNaseH各2U-50U，16℃保温2小时，后加入T4 DNA Polymerase1 10U，继续16℃保温5-10分钟，保温结束后，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀，静置1分钟，14,000rpm，室温离心5分钟，小心将上清取入新的离心管中，加入1/10体积醋酸钠及2.5倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置2小时后取出最大转速离心3分钟。去上清后加入75％乙醇1毫升，短暂离心取上清，重复一次，室温晾干，加DEPC水重新溶解cDNA。
5.如权利要求2所述的降低膜体系表达文库假阴性率的一种建库方案，其特征在于步骤(2)溶解的cDNA平均分成三份，分别连接不同的建库接头attB1 Adapter F1和R1、attB1Adapter F2和R2及attB1 Adapter F3和R3各1-4微克，加入T4连接酶1U 16℃连接16-24小时。
表1 文库接头及序列
引物名称 引物序列(5’-3’) RFα-F TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG RFα-R CCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCC RFβ-F TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA RFβ-R TCCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCC RFγ-F TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGAA RFγ-R TTCCAACTTTTTTGTACAAAGTTGTCCCC
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