[发明专利]组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法

说明书

本发明公开了组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物及制备N‑乙酰葡萄糖胺的方法；首先涉及脱脂南极磷虾粉的预处理，通过碱性蛋白酶预处理回收脱脂南极磷虾粉中的多肽，使原料得到充分利用，并且提高了脱脂南极磷虾粉中几丁质相对含量。其次涉及三种几丁质酶的联合水解，通过联合水解使水解效率大大提高，使还原糖的产量得到提高。最后，通过混合酶体系中加入OfHex1酶得到N‑乙酰葡萄糖胺，且水解效率很高，使组合酶法利用脱脂南极磷虾粉生产N‑乙酰葡萄糖胺成为可能。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及组合酶法降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物以及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法。

背景技术

N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)是一种葡萄糖衍生物，常以β-1,4糖苷键连接成高聚物存在于多种生物的结构成分中。因其具有多种生物活性，如修复关节损伤，治疗肠胃炎以及皮肤美白等，广泛应用于食品化妆品添加剂中。

工业生产N-乙酰葡萄糖胺的方法目前主要是利用化学法合成，其产量低，成本高，环境污染严重。另一种方法是通过降解几丁质(chitin)生产N-乙酰葡萄糖胺，几丁质作为自然界中储量第二大的生物质，是一种廉价易得的原料，传统几丁质降解的方法是利用强酸水解，存在对环境污染较为严重，产品存在副产物难以分离等缺点。

近年来，酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺因其产品质量高，生物活性好，环境污染小成为一种充满潜力的新兴工艺。然而，酶法生产目前仍存在挑战。一个是原料的选择与处理，另一个是酶的生产效率。针对以上两个问题，既要在原料的选择和运用上选择成本低的原料，又要提高酶的生产效率。已知南极磷虾含量丰富，每年在不影响生态平衡下的捕获量是5000万吨，而世界的捕获量远达不到此数量。而南极磷虾目前仅仅用于虾油的提取，而剩下的残渣还没有得到有效的利用。

发明内容

本发明为了解决背景技术中所述及的问题，公开了一种组合酶法降解脱脂南极磷虾粉多肽中间产物回收的方法，以及制备N-乙酰葡萄糖胺的方法。

首先，所述的降解脱脂南极磷虾粉回收多肽中间产物的方法，其包括下述步骤：

脱脂南极磷虾粉溶于pH7.5-8.5的缓冲液中混匀，再加入10000-15000U碱性蛋白酶，在40-45℃条件下水浴20-24h；抽滤得到预处理脱脂南极磷虾粉和含蛋白上清；用喷雾干燥法对预处理后的脱脂南极磷虾粉进行干燥处理，得到干燥样品。针对利用此方法所得的干燥样品中的多肽含量进行检测，分别对未处理样品和处理后脱脂南极磷虾粉进行凯氏定氮，计算得到预处理回收多肽含量约为40％；其中，含有包括天冬氨酸为主的至少17种氨基酸成分。

优选的情况下，对于上文所述的方法中，所述脱脂南极磷虾粉溶于缓冲液的比例为(1～2)g:(3～8)mL。进一步优选，脱脂南极磷虾粉溶于缓冲液的比例为1g：4mL。优选的情况下，对于上文所述的方法中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液、Tris缓冲液和Bis-Tris缓冲液。

本发明所述的一种组合酶法降解脱脂南极磷虾粉制备N-乙酰葡萄糖胺的方法，其包括下述步骤：

向pH5.5-6.5的缓冲液中加入所述回收多肽中间产物的方法中得到的干燥样品，使其终浓度为15-25mg/mL，再加入终浓度为6～24μM的组合酶，40℃水浴4～24h；所述的组合酶为SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1；上述组合酶中四种酶的添加量分别为43～45％、35～37％、17～19％、0～1.5％。

优选的情况下，对于上文所述方法中，所述的组合酶SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC和OfHex1的添加量分别为43.90％、35.90％、18.90％、1.30％。

优选的情况下，对于上文所述的方法中，所述的组合酶SmChiA mutant、SmChiB、SmChiC、OfHex1的终浓度为6μM。