[发明专利]一种工程菌及其在生产丙酮酸中的应用

说明书

本发明公开了一种工程菌及其在生产丙酮酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的重组大肠杆菌同时表达了外源L‑乳酸脱氢酶和NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了丙酮酸吸收基因，进一步还强化表达了乳酸转运基因、丙酮酸转运基因、NAD合成基因。本发明在在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了双酶共表达的工程菌，实现了丙酮酸的高效生产并减少杂质生成。

技术领域

本发明涉及一种工程菌及其在生产丙酮酸中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(Pyruvate)，又名2-氧代丙酸或乙酰甲酸，是一种酸性较弱的有机酸。丙酮酸在化工、食品、医药等领域有着广泛的应用。

目前丙酮酸的生产主要有化学法和生物法。化学法通过催化剂的作用下氧化乳酸生产丙酮酸，但成本较高污染严重(CN201510848841.2等)。生物法主要有乳酸转化法和直接发酵法。以葡萄糖为原料发酵产丙酮酸(WO8901523、CN201310722490.1、CN201510205724.4等)通常发酵时间较长，并且从杂质发酵液系统中提取丙酮酸成本较高。以含有乳酸氧化酶等的工程菌或野生菌(WO9500656、CN200710156905.8、CN201110092393.X)，可产丙酮酸，但此过程中会产生过氧化氢，即使共表达过氢化氢酶或外部添加过氢化氢酶也无法避免丙酮酸被氧化产生乙酸，从而影响收率及纯化效果。

本发明以过对大肠杆菌的改造，改变其对底物和产物的转运及辅酶的效合成，并利用廉价的底物L型乳酸在不产过氧化氢的情况下转化生产丙酮酸。

发明内容

基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了不产过氧化氢的转化乳酸产丙酮酸的生产方法，在改造大肠杆菌转运及辅酶合成体系的基础上，构建了双酶共表达的工程菌，实现了丙酮酸的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能生产丙酮酸并减少杂质生成的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。

本发明的第一个目的是提供能低成本生产纯丙酮酸的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌同时表达了外源L-乳酸脱氢酶和NADH氧化酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了丙酮酸吸收基因。

在一种实施方式中，所述外源L-乳酸脱氢酶为乳酸菌来源的L-乳酸脱氢酶。外源的NADH氧化酶为乳酸菌来源的NADH氧化酶。

在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来自于Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus plantarum ATCC 14917。

在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_003131075.1、KRL33571.1的序列。

在一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_JXJZ01000017REGION:18532..19509、AZEJ01000016REGION:16296..17249的序列。

在一种实施方式中，所述NADH氧化酶来自Lactococcus lactis ATCC 19257、Lactobacillus sanfranciscensis DSM20451、Lactobacillus brevis ATCC 14869。

在一种实施方式中，所述NADH氧化酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_032950924.1、WP_056958268.1、ERK43827.1序列。