[发明专利]一种检测小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA扩增方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种小鼠脑脊髓炎病毒RT‑RPA引物组、试剂盒及其检测方法，可以实现实时检测小鼠脑脊髓炎病毒，在恒温条件下20分钟即可完成反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高的特点。本发明的反应检测灵敏度达到1×10¹copies，为快速检测提供了技术支持，在病原微生物检测中有极高的应用价值。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术研发领域，具体涉及一种快速检测小鼠脑脊髓炎病毒RT-RPA方法及其试剂盒。

背景技术

小鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus，TMEV)是实验动物小鼠种群中常见的病毒性病原之一。该病毒属于微RNA病毒科，心病毒属(Cardiovirus)。TMEV基因组包含一个单股负链RNA，长度约8100bp。在小鼠群中，TMEV感染是一个比较普遍的疾病，已经有研究报道其感染率为8％～35％。小鼠感染该病毒后大多数无可见临床症状，呈隐性感染；但是可以导致感染小鼠发生免疫反应进而引发免疫紊乱等病理现象，这不仅对小鼠本身造成身体伤害，而且还会干扰生命科学研究的结果，因此TMEV是国家标准中SPF级小鼠需要排除的病原体。近年来有研究发现，将TMEV接种在大鼠的大脑，可以导致其发生可见的临床症状，如后肢瘫痪和体重减轻等症状。

目前，TMEV诊断方法主要分为血清学检测和病原学检测。血清学检测主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)等。由于免疫功能缺陷动物如裸鼠或者基因改造小鼠等，不能和正常小鼠产生一样的免疫反应；病毒感染早期机体尚未产生抗体，该阶段进行抗体检测势必导致假阴性结果；而且无法对小鼠笼具和垫料等病毒可能污染的环境进行检测，因此血清学检测应用具有局限性。病原学检测方法尤其是RT-PCR，操作简单、灵敏度高，已经成为病毒监测的一个重要分子学技术手段。但是普通PCR还是荧光定量PCR，都至少需要一个小时反应时间，而且需要昂贵的仪器，许多基层单位和偏远地区无法承担。因此，一种能检测小鼠脑脊髓炎病毒的重组酶聚合酶扩增(RPA)的试剂为目前所需。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一对检测小鼠脑脊髓炎病毒的引物组和探针；

本发明的另一目的在于提供一种小鼠脑脊髓炎病毒的试剂盒；

本发明的再一目的在于提供一种小鼠脑脊髓炎病毒的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的引物组，其核苷酸序列如下所示：

TMEV-F：5’-TTCCTATGGAGATGACCTATTAATTGGAAC-3’；

TMEV-R：5’-TCAGAGGAAAGGTGGTGGTCTTGTTGGCAG-3’。

一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的荧光探针，其核苷酸序列如下：

TAATCTTATAACCGAAGGGGGCTAATCTTT-THF-TTTAACAAGATTAAA。

一种检测小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组。

进一步的，该试剂盒中还含有上述所述的探针。

进一步的，该试剂盒中还含有目的基因的重组酶聚合酶扩增试剂。

一种小鼠脑脊髓炎病毒的RT-RPA的检测方法，包含以下步骤：

1)提取样品RNA；

2)以提取的RNA作为模板，使用上述所述的引物组TMEV-F、TMEV-R，以及上述所述的探针进行RT-RPA扩增反应获得扩增产物；

3)对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否含有小鼠脑脊髓炎病毒。