[发明专利]一种延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种通过保护固态口蹄疫病毒抗原而延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒，先制备抗原保护剂：配制0.01M的PBS缓冲液作母液，依次加入10％BSA、10％的海藻糖、3％枸杞多糖、3％芦荟多糖、0.01％硫柳汞、0.05％吐温‑20；充分混匀后经0.45nm孔径滤膜过滤除菌，经无菌检验合格后方可使用；向制备好的口蹄疫病毒抗原固定板中加入抗原保护剂，可将酶标板内口蹄疫抗原稳定性保存期在4‑6℃条件下延长至12个月，采用此酶标板制备的试剂盒比目前此类试剂盒的保存期长一倍，降低了养猪场购买试剂盒的成本，也减小了兽医工作的管理强度。

技术领域

本发明属于生物诊断检测技术领域，具体涉及一种通过保护固态口蹄疫病毒抗原而延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫是重大动物疫病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其归为A类动物疫病之首。口蹄疫病毒属小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，共7个血清型，70多个亚型。口蹄疫的预防和控制是世界性难题，全球每年因该病造成的直接经济损失到数百亿美元。每年我国投入数十亿人民币用于口蹄疫的防控和新技术研究，然而各地口蹄疫疫情仍然不断出现。疫苗免疫是目前我国预防和控制口蹄疫疫情爆发和蔓延的主要手段，由于口蹄疫病毒抗原免疫原性较差，疫苗质量参差不齐，易感动物需多次接种疫苗才能达到理想的抗体水平，因此及时监测疫苗免疫后动物的抗体水平、评价免疫效果并采取相应的应对措施尤为重要。

OIE推荐的口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测方法为病毒中和试验、液相阻断酶联免疫吸附试验(LPB-ELISA)和固相竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)(见OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册，2012年第七版版，166-169页)。cELISA检测方法是OIE指定的国际贸易检测方法，与LPB-ELISA检测方法相比敏感性相同，但特异性更高。国外目前已有商品化口蹄疫的cELISA检测试剂盒，其中有些cELISA检测试剂盒应用的是表达抗原，由于表达抗原使用线状氨基酸序列，可以实现直接固化在酶标板上，但不能覆盖全病毒，存在抗原覆盖面较窄等方面的问题，因此OIE不进行推荐使用。另一部分口蹄疫cELISA试剂盒是通过包被兔抗口蹄疫病毒抗体，然后捕获口蹄疫病毒146S抗原(完整病毒颗粒抗原)，使抗原固定在酶标板上，封闭液封闭后用于抗体检测。但是口蹄疫病毒抗原易于变性，在pH8.0以上、pH6.5以下会很快失活，对温度也极为敏感，由于其它试剂的相对稳定，所以口蹄疫病毒抗原的稳定性是影响试剂盒的保存期的最主要因素，而目前此类口蹄疫cELISA试剂盒的在4-6℃条件下的保存期仅为6个月，成本较高，且对养猪场的兽医跟踪管理要求较高。因此，如果能保护口蹄疫病毒抗原在酶标板上的稳定性，就可以延长保存期，对于口蹄疫抗体的检测来说是一项重要的技术进步。

中国农业科学院兰州兽医研究所王永禄等发明的口蹄疫抗原保存技术(申请号02124649.1)用于液态口蹄疫抗原保存，截至目前国内无用于口蹄疫cELISA固态抗原的专门保护剂及相应试剂盒。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出一种延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒。

本发明的延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒，通过如下步骤制备而成：

1)制备抗原保护剂：配制0.01M的PBS缓冲液作母液，依次加入10％BSA、10％的海藻糖、3％枸杞多糖、3％芦荟多糖、0.01％硫柳汞、0.05％吐温-20；充分混匀后经0.45nm孔径滤膜过滤除菌，经无菌检验合格后方可使用；

2)制备口蹄疫病毒抗原固定板：将兔抗口蹄疫病毒抗体用pH9.6的包被液稀释，50μl/孔加入到96孔酶标板内，4℃静置16小时；倒掉包被液，用0.01M的PBST洗涤3遍；每孔加入口蹄疫病毒抗原悬液50μl，37℃反应1小时；倒掉液体，用0.01MPBST洗涤3遍，即为口蹄疫病毒抗原固定板；