[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用

说明书

本发明提供一种通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用，本发明通过基因工程的方法通过敲除地衣芽孢杆菌基因组内的lrpC基因，得到地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了10%以上。

技术领域

本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌杆菌属于革兰氏阳性菌，其是公认的具有生物安全性(GRAS)的重要工业微生物菌株。由于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、工业应用价值高等特点，近年来被广泛用来研究。

目前，地衣芽胞杆菌主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等生物化工产品。杆菌肽又名枯草菌素，其可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素(如青霉素、庆大霉素等)具有协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

地衣芽胞杆菌DW2是一株产杆菌肽的野生菌株，该菌株目前已保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2011344。

杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)，D-苯丙氨酸(D-Phe)，异亮组氨酸(His),D-天冬氨酸(D-Asp),天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys),D-谷氨酸(D-Glu)，半胱氨酸(Cys)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)11种氨基酸。亮氨酸应答蛋白(Lrps)是一种转录调控因子，LrpC(LrpC为lrpC基因的表达产物)作为Lrps家族的成员，其也是一种亮氨酸应答蛋白。LrpC能在细菌和古细菌中调节多种细胞过程的转录因子，其可以调节100多个基因的表达。但是，目前的研究尚未解析出LrpC的具体调控机理，因此，也无法推断出：LrpC与亮氨酸合成以及杆菌肽产量之间的关系。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法，此构建方法是通过敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组中的lrpC基因来构建地衣芽孢杆菌基因工程菌，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。

通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的方法，包括以下步骤：

(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；

(2)采用限制性内切酶Xba I和Sac I对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；

(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶Xba I和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；

(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC；

(5)将lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lrpC基因的上游臂或lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；