[发明专利]一种黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法

权利要求书

1.一种黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、剪取黑果枸杞无菌苗从上至下第4-5片幼嫩叶片，剪去叶片两端获得伤口后接种于叶片分化培养基中预培养，至叶片膨大生长出少量绿色愈伤组织；其中，叶片分化培养基的成分为：MS基本培养基+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.5mg/L KT；

S2、将获得的带愈伤组织的叶片转移至含1％(v/v)的DMSO和秋水仙碱的液体叶片分化培养基中进行多倍体浸泡诱导，秋水仙碱浓度为50mg/L，避光黑暗条件处理1-2天；然后使用无菌水清洗叶片后转入上述叶片分化培养基，继续22-26℃光照培养至长出不定芽；

S3、将加倍过后的不定芽转入生根培养基中，22-26℃生长至不定芽高度达到3cm时进行多倍体检测，以获得多倍体再生植株；其中，生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+0.1mg/L IBA；其中，

步骤S1中，预培养时间为8-11天；

步骤S3中，不定芽的生根培养的时间为10天。

2.根据权利要求1所述的黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法，其特征在于，所述步骤S3中，多倍体检测用流式细胞仪和根尖染色体计数法实现。

3.根据权利要求2所述的黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法，其特征在于，流式细胞仪检测用染液为10μg/mL的DAPI染液，流式细胞仪所用的裂解液配方为：

裂解液成分	配置1L含量
2·6H2O]]>	9.14g
MOPS	4.19g
3C6H5O7]]>	7.74g
Triton X-100	5ml
PVP-40	10g

。

4.根据权利要求2所述的黑枸杞不定芽途径高效诱导多倍体的方法，其特征在于，所述根尖染色体计数方法的具体步骤为：

1)预处理：植株根长至1-1.5cm时剪取0.5cm根尖置于对二氯苯水溶液4℃处理4h；

2)固定：将根尖用卡诺固定液固定24h后用蒸馏水洗3次；

3)解离：在60℃条件下用1M HCl处理根尖12-15min，清水洗4次；

4)压片：取出根尖，切去根冠和伸长区，用解剖针轻戳根尖，滴一滴改良苯酚品红，染色10-15min后盖上盖玻片，施加少量压力使细胞舒展，100x物镜观察获得的变异株组培苗根尖细胞的中期染色体数目。