[发明专利]检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒及其使用方法

说明书

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人BCR‑ABL融合基因的试剂盒。本申请的试剂盒采用一步法逆转录对人BCR‑ABL融合基因进行检测，试剂盒包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂包括BCR‑ABL PCR反应液、内参PCR反应液和混合酶液。本申请的试剂盒将荧光PCR和逆转录技术相结合，采用一步法检测样本中BCR‑ABL210融合基因的表达水平，具有高特异性、高准确性和高灵敏度的技术优势。

技术领域

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人BCR-ABL融合基因的试剂盒及其使用方法。

背景技术

白血病(Leukemia)是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞发育程度可分为急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根据白血细胞的形态和生化特征，又可分为急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性粒－单核细胞白血病(CMML)等。

白血病是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率为2.76/10万人口，我国估计有5万以上患者，且白血病患者的数量正逐年增加。白血病的发病率虽然在肿瘤发病率中排第6位，但在儿童和青少年恶性肿瘤的发病率和死亡率中均占第1位。近年临床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。这些染色体易位畸变时大部分情况下会产生新的融合基因，这些融合基因可作为用于诊断不同类型白血病和淋巴瘤的分子标志。不同类型的白血病化疗和放疗的方案是不同的。所以，对这些分子标记进行检测分析有利于治疗方案的确定和分析预后。因此，世界卫生组织2000年发布的白血病和淋巴瘤诊断标准已将染色体易位后融合基因检测作为最重要的指标之一。

BCR-ABL融合基因是各类白血病中研究的最为深入的部分，BCR-ABL和费城(Ph)染色体的形成相关，是白血病中最常见的染色体异常。Ph染色体形成的分子基础是9号染色体上的C-ABL基因易位到22号染色体上的BCR基因上形成BCR-ABL融合基因，即t(9；22)(q34；q11)易位。根据断裂点的不同，BCR-ABL融合基因可分为3种类型，P190,P210,P230，CML病人约90％～95％病人含有P210，因此临床上把检测P210作为CML分型诊断依据、疗效评价，以及微小残留病的检测和预后评估的可靠指标。在CML中，还有一部分的Ph染色体阴性的CML患者，其BCR-ABL融合基因也为阳性，这可能是一部分的Ph染色体不易看清楚，据统计，在CML病人中，BCR-ABLP210融合基因的阳性率为99％，这也说明分子水平的检测较细胞遗传学的方法更为敏感。

此外，BCR-ABLP210融合基因的水平与临床疗效有很好的相关性，并能预先对临床病情变化提出警示，对于肿瘤微小残留病的监测和及时调整治疗方案都有重要意义，因此，定期检测BCR-ABLP210融合基因水平是必要的。美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的《CML临床实践指南》(2012版)明确将P210检测作为慢粒白血病患者初筛和酪氨酸激酶抑制剂疗效跟踪的预后指标，并提出了更早的治疗方案决策时间点(3个月)，同时建议IM治疗3个月内未实现BCR-ABL/ABL水平≤10％的患者，换用第二代TKI药物，考虑异基因造血干细胞移植或临床试验，并停用IM。

目前对白血病的检查主要有血象检查、骨髓涂片检查、血液生化检查等，但这些都没有对融合基因进行检查，获得的结果误差范围也比较大。目前检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交技术(FISH)，PCR和基因芯片等。

其中，FISH技术是利用已知的核酸探针，与组织、细胞染色体标本中相关核酸序列杂交，通过间接免疫荧光反应，直接定位基因，适用于多种临床标本，包括血液，骨髓、组织印片，甚至石蜡包埋的组织标本。由于FISH对处于分裂中期和间期细胞都能检测，克服了常规的细胞遗传学诊断淋巴瘤和白血病必须细胞处于分裂中期的障碍，但最低检出量较低，主要用于初诊和复发的检测。