[发明专利]一种基于QPCR定量检测畜禽肉中羊源性成分的方法

权利要求书

1.用于鉴定羊源性成分含量的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括内参基因Ref-8引物正向序列：5′-GCTTGAGGGCTGAGTGATAGATTC-3′，Ref-8反向序列：5′-ACACATAAGCTCATCGCAAATCAT-3′，Ref-8探针序列：5′-FAM-CCTGCCTGAAGCATCCCAGTGTGTTT-BHQ1-3′；羊源种属特异性基因Mutton-3引物正向序列：5′-GATCAAAGGCAGAGATTACCAGTCA-3′，Mutton-3反向序列：5′-TTGTGGTTTGTGATTGATTTTAGTCA-3′，Mutton-3探针序列：5′-FAM-TCGCTCTTCCCCTGCTCCAGACAC-BHQ1-3′。

2.一种采用权利要求1所述内参基因和羊源种属特异性基因，快速鉴定羊源性成分含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的内参基因PCR引物和探针及Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液，加入供试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分分别为：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)预混液10μL，上下游引物各1μL(浓度为10μmol/L)，探针引物0.4μL(浓度为10μmol/L)，模板DNA 1μL(浓度为50/μL)，用灭菌去离子水补齐至20μL；

反应程序：95℃变性5min；进行45次循环扩增反应(95℃变性15s，60℃退火延伸1min)；在第二阶段的退火延伸(60℃)时段收集荧光信号。

(2)构建羊源性成分定量检测标准参照物，采取SDS-硅胶柱改良方法提取DNA梯度稀释，配制标准曲线。标准溶液中羊源性成分的浓度为50、10、5、1、0.5ng/μL，每个反应加入1μL DNA做模板，每个反应分别对应50、10、5、1、0.5ng，每个反应设置3个平行。根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值及初始模板浓度的对数分别绘制Ref-8内参基因和Mutton-3羊源特异性基因的标准曲线。

(3)设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值和靶标浓度，并记录。按照公式A＝B/[B+(C-B)/D]×100％，计算出试样中羊源性成分种属特异性基因百分含量。

3.如权利要求2所述的鉴定方法，公式中A为羊源性成分种属特异性基因百分含量，B为Mutton-3羊源种属特异性基因的靶标浓度，C为Ref-8内参基因的靶标浓度，D为羊源性成分中掺入其他动物源性成分的校正系数，即为羊基因组大小/掺入动物基因组大小。