[发明专利]一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。本发明以谷氨酸棒状杆菌S9114作为出发菌株，使用谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的穿梭表达载体pJYW‑4表达了乙酰氨基葡萄糖合成途径中的一个关键酶基因：来源于秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰转移酶GNA1，并通过在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列来加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，提高乙酰氨基葡萄糖的产量，得到了产乙酰氨基葡萄糖重组谷氨酸棒杆菌，产量达到6.1g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。G1cNAc是新型的生化药品，在食品、医药和化妆品等领域都具有广泛应用。G1cNAc在自然界中存在范围广泛，尤其是海洋生物类动物的外骨骼中含量最高，所有生物均可以合成GlcNAc。GlcNAc是缔结组织、软骨组织及关节液等的关键组成物质，具有重要的药用效果。GlcNAc在临床上是关节炎类疾病的关键药物，其科学性己经临床试验相继验证。GlcNAc可以提高关节抗炎活性和蛋白活性，其效果好于透明质酸。GlcNAc可以诱导白血病细胞的分化，很可能成为新的低毒、高效的治疗白血的候选药物。同时GlcNAc能够促进人体粘多糖的合成，可以增强人体的抵抗力和人体免疫力。

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，它作为一种食品级的微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸等等。近年来学者们开始研究利用谷氨酸棒杆菌生产非氨基酸物质。相比于大肠杆菌来说，谷氨酸棒杆菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也基因工程领域发挥着重要作用。在谷氨酸棒状杆菌中因为不存在氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，不存在通过葡萄糖合成N－乙酰氨基葡萄糖的途径。因此只有高效表达外源氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因才能使得谷氨酸棒状杆菌具有合成N-乙酰氨基葡萄糖的能力。

发明内容

本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，并在基因3’UTR添加了重复性回文序列以后在不影响谷氨酸棒杆菌生长情况的同时也提高了其GlcNAc产量。

本发明的第一个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌，表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶。

在本发明的一种实施方式中，还在所述重组谷氨酸棒杆菌的GNA1基因终止密码子下游位置添加重复性回文序列，重复性回文序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌S9114。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶的基因如NCBI-Gene ID:179437。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因通过表达载体pJYW-4进行表达，以启动子P_tac控制葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_tac由P_Trp启动子和P_lac启动子杂合而成，具有更高的转录效率，启动子P_tac的构建过程参见2014年公开的论文Construction of anovel expression system for use in Corynebacterium glutamicum.Plasmid 75,18-26.。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述谷氨酸棒杆菌工程菌的方法，具体方法如下: