[发明专利]程序性死亡受体1抗体磁珠的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种程序性死亡受体1（PD‑1）抗体磁珠的制备方法：将14株抗人PD‑1单克隆抗体分别与羧基磁珠偶联，制备PD‑1抗体磁珠；所述14株抗人PD‑1单克隆抗体源于加拿大YES公司生物技术研究有限公司，14株抗人PD‑1单克隆抗体的克隆号分别为：7E5，1H8，1C4，9A5，9B4，7C9，3E5，7G12，9E11，5B2，5H7，2H7，B1C4，2C4。本发明还公开了上述PD‑1抗体磁珠应用于CIK、CART、TIL淋巴细胞免疫治疗领域，用于剔除PD‑1阳性细胞。本发明优化抗体与磁珠的偶联方案，使得磁珠表面抗体的偶联量达到1ml磁珠结合1mg抗体，偶联抗体后磁珠表面荧光信号增强，本发明制得的抗体磁珠可以捕获PD‑1阳性细胞。

技术领域

本发明涉及一种程序性死亡受体1(PD-1)抗体磁珠的制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

免疫系统能够识别并清除表达新抗原的异己成分以维持内环境稳态，癌变的异常细胞亦是其清除对象。T细胞介导的细胞免疫反应发挥着重要的调控作用，形成一个由多步级联反应构成的抗肿瘤免疫循环。在抗肿瘤免疫循环中存在多个因素可增强或抑制对肿瘤细胞的免疫清除，其中就包括程序性死亡因子1(PD‐1)与其配体组成一个重要的免疫抑制性检查点[3‐6]，即PD‐1/PD‐L1免疫检查点。

程序性死亡因子PD-1属于CD28家族成员。PD-1是一个诱导表达的蛋白，即T细胞在未被激活的时候是几乎没有PD-1的表达的，只有在T细胞活化之后，PD-1才会被诱导表达。除了在活化成熟的T细胞上有表达，PD-1还在胸腺的双阴性(CD4^-CD8^-)T细胞、活化的NK细胞、单核细胞和未成熟的朗格汉斯细胞上呈低表达。PD-1与毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)有20％的同源性。PD-1是由268个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区尾部有2个独立的酪氨酸残基，氮端的酪氨酸残基参与构成一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，碳端酪氨酸残基则参与构成一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1与PD-L1在激活的T细胞结合后，促使PD-1的ITSM结构域中的酪氨酸发生磷酸化，进而引起下游蛋白激酶PI3K等去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控T细胞活性的作用。

PD-1及其配体PD-L1是一对免疫共刺激因子，近年来，PD-1/PD-L1免疫检查点因参与肿瘤免疫逃逸机制而备受瞩目。肿瘤浸润性T淋巴细胞表达的PD-1与肿瘤细胞表达的PD-L1相互作用而激活PD-1/PD-L1信号通路，可抑制效应T细胞的抗肿瘤活性，导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，最终使肿瘤细胞逃避免疫清除。几乎所有类型的人类肿瘤都有表达PD-L1，如黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、头颈癌、胃肠癌、膀胱癌、卵巢癌和血液系统恶性肿瘤等。而阻断PD-1/PD-L1这一免疫检查点可有效改善肿瘤免疫微环境，提高效应T细胞对肿瘤细胞的免疫监视和清除能力。以阻断此免疫检查点的抗体药物为基础的免疫疗法已成为肿瘤治疗的新策略。