[发明专利]一种用于检测白术叶斑病致病菌的引物及其方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域。提出一种用于检测白术叶斑病致病菌的引物及其方法和应用，所述的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，通过基因组DNA提取，通用引物进行第一轮扩增，特异性引物进行第二轮扩增，从而检测白术叶斑病致病菌。本发明具有检测灵敏度极高，即使在Phoma herbarum处于潜伏侵染，不表现症状的时候也能检测出病原菌的存在，最低检测浓度为1fg/μL；同时具有特异性强，不会被其他病原菌干扰，准确率高的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测白术叶斑病致病菌的引物及其方法和应用。

背景技术

白术(Atractylodes macrocephala)为菊科苍术属植物白术的干燥根茎，在湖北、安徽、浙江、湖南等地广泛种植，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之功效，适用于脾虚食少、腹胀泄泻、痰饮、水肿、自汗、胎动不安等症，为多种中成药的原料药。

白术叶斑病的发病率为45％-80％，有的田块可达100％，病害每年对白术产量造成的损失超过40％。目前白术叶斑病的发生呈加重趋势，每年都造成大量损失，严重挫伤贫困山区药农种植积极性，目前湖北省白术种植面积每年减少约10％，长期以往十分不利于我省中药材白术特色产业的发展。由于缺乏植物保护专业人才的指导，存在乱施滥用各类化学药剂的情况，不但未能有效防治病害，而且增加了致病菌的抗药性和环境污染，这些对白术产量和品质影响较大，严重威胁白术产业的进一步发展和壮大。传统病原菌的鉴定必须在植株表现出症状后才可以实施，需要病原菌分离、纯化培养、科赫氏法则验证、形态学观察、生理生化性状等去鉴定，顺利的话完成整个过程需要大约20天，但是一旦产生其他杂菌污染培养基，就会影响鉴别速度，同时长时间的鉴定耽误防治时机。传统鉴定存在鉴定不准、耗时、费力的缺点，完全满足不了植保工作精准、快速防控的要求。

为了解决白术叶斑病快速蔓延的现状，实现快速、精准的鉴定Phoma herbarum引起的白术叶斑病的目的，急需建立一种能够实现“便捷”、“快速”与“准确”目标要求的Phomaherbarum引起白术叶斑病的快速检测方法。本发明根据Phoma herbarum与同属其它微生物的ITS区域(基因转录间隔区)碱基组成差异而设计特异性引物，采用巢式PCR(Nested PCR)对Phoma herbarum进行分子检测，检测操作简单、准确性好、灵敏度较高，国内外均未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测白术叶斑病致病菌的引物，并提了白术叶斑病致病菌巢式(Nested)PCR快速检测方法，其具有快速、精准，灵敏的特点，有效提高了检测Phoma herbarum引起白术叶斑病的便捷性、及时性和准确度。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种用于检测白术叶斑病致病菌的引物，所述的特异性引物根据PhomaherbarumITS基因序列(NCBI Accession No.KY780194)与其他Phoma属真菌差异性核酸碱基，设计对Phoma herbarum具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物BZYBF：5`GTCTTTTGAGTACCTTACGTTTCCT 3`；

下游引物BZYBR：5`AAGGCGAGTCTACAGGAGACAAACA 3`；

此外，本发明提供了一种快速、准确、操作简单的白术叶斑病致病菌的快速检测方法，具体包括以下步骤：

1)提取待测样品基因组DNA；

2)利用通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增；所述的通用引物为：ITS1：5`TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3`；ITS4：5`TCCTCCGCTTATT GATATGC 3`；