[发明专利]采用AMF单个孢子微量DNA进行PCR预处理的方法

说明书

本发明采用AMF单个孢子微量DNA进行PCR预处理的方法，是通过湿筛倾析AMF孢子；剪出小方片放置在无菌滤纸上；在小方片上扎出小坑；挑取未开裂的AMF孢子放在小坑内；用微量注射器针头压碎孢子并注射无菌甘油清洗掉残留在针头上的单个孢子内含物；将带有AMF单个孢子破碎物与甘油的小方片放入PCR管底部，再加入PCR所需要的正反引物、Taq酶和PCR级别的无菌水，快速离心，即可进行PCR。无菌甘油快捷地清洗可能沾有AMF单个孢子内含物的针头，加之甘油又能提高微量DNA的PCR扩增效率，将AMF单个孢子DNA等内含物暴露在无菌小方片上，可直接将其放入PCR管底部，与PCR的其他反应液接触，进行PCR反应。所涉及的装置易获得，可重复利用，操作简单，可行性高，成本低廉。

技术领域

本发明涉及一种丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）单个孢子PCR预处理的方法，具体是一种采用AMF单个孢子微量DNA进行PCR预处理的方法，属于菌种检测领域。

背景技术

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤中广泛与植物共生的一类真菌，其种类繁多，现在已经被单独规划为球囊菌门。由于其与植物建立互利共生的关系，所以人们需要致力于鉴定和发现不同特性的菌株或新菌种。但在鉴定与发现新菌种的过程中，由于不同菌种形态特征难于辨别，不得不借助于分子鉴定。AMF的分子鉴定即采用AMF单个孢子的DNA作为模板，通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增特定区域的基因片段，通过比对该基因片段与已知菌种的同源基因片段的异同来鉴定菌种。虽然AMF分子鉴定由来已久，但由于AMF孢子的孢子壁厚，关于采用AMF单个孢子微量DNA进行PCR预处理的方法过于繁琐或成本比较昂贵，例如采取反复冷热交替的方法使单个孢子破碎，然后再小心的转移单个孢子内微量DNA进行PCR；还有特定公司采用成本昂贵的裂解液进行提取单个孢子DNA，并实行技术封锁。这些程序繁琐或成本昂贵的预处理方法增加了AMF分子鉴定的阻力。目前，尚没有一种简单廉价且可操作性强的预处理方法，既能简单的将AMF单个孢子破壁又有利于单个孢子内微量DNA转移进入PCR体系。

发明内容

本发明的目的是克服目前传统AMF单个孢子PCR预处理方法所存在的缺陷，而公开一种采用AMF单个孢子微量DNA进行PCR预处理的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

a.通过湿筛倾析获得若干个AMF孢子，将一定数量的AMF孢子在无菌水中超声清洗，抽滤在无菌滤纸上，并放置于超净工作台内，以下步骤均在超净工作台内进行；

b.用灭菌的剪刀将无菌PCR管盖剪出一个平整的小方片，放置在无菌滤纸上；

c.将无菌滤纸放置在解剖镜载物台上，使用火焰灭菌的微量注射器针头在小方片上扎出一个小坑；

d.使用火焰灭菌的解剖针挑取一个饱满未开裂的AMF孢子放在小坑内；

e.用微量注射器吸取无菌甘油，在解剖镜下利用微量注射器的针头将AMF单个孢子在小坑内压碎，然后推出无菌甘油，以清洗掉残留在针头上的单个孢子内含物；

f.用火焰灭菌的镊子将带有AMF单个孢子破碎物与甘油的小方片放入PCR管底部，完成预处理过程，再加入PCR所需要的正反引物、Taq酶和PCR级别的无菌水，快速离心，即可进行PCR。

本发明利用微量注射器针头来制造小方片上的小坑，将AMF单个孢子放入小坑中，针状的微量注射器针头可将坑底的AMF单个孢子压破，使其DNA等内含物出来，再利用微量注射器内无菌甘油快捷地清洗可能沾有AMF单个孢子内含物的针头，加之甘油又能提高微量DNA的PCR扩增效率。将AMF单个孢子DNA等内含物暴露在无菌小方片上，可直接将其放入PCR管底部，便与PCR的其他反应液接触，进行PCR反应，所涉及的装置易获得，可重复利用，操作简单，可行性高，成本低廉。

具体实施方式