[发明专利]一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法

权利要求书

1.一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，其特征在于：包括如下过程：

SS01、检测细胞存活度：

具体包括评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞是否具细胞毒性，评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞型态变化，评估皮肤细胞周期；

SS02、评估兰花生长点萃取物之保护因紫外线及氧化伤害而造成的DNA损伤：

具体包括兰花生长点萃取物保护环状DNA效应评估、兰花生长点萃取物保护片段化DNA效应评估；

SS03、评估兰花生长点萃取物修护因紫外线造成皮肤细胞损伤：

具体包括评估萃取物修护皮肤细胞经紫外线作用后细胞存活度、评估侦测DNA损伤之环丁嘧啶二聚体生成量。

2.根据权利要求1所述的一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，其特征在于，所述SS01中检测细胞存活度中评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞是否具细胞毒性的过程如下步骤：

S011、皮肤细胞培养：取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％CO₂培养箱中培养至少24小时；

S012、萃取液配置：取冷藏备用的兰花生长点萃取物并配置成不同浓度梯度的萃取液；

S013、细胞毒性评估：向S011中的96孔培养板加入S012配置的不同浓度的萃取液，反应后移除培养液，并用无菌PBS清洗一次后重新加入培养液以及10ul的MTT溶液反应，在37℃以及5％CO₂培养箱中培养反应4小时后移除培养液，加入100μL的DMSO溶解甲臢沉淀物，最后于波长570nm下测定吸光值。

3.根据权利要求1所述的一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，其特征在于，所述SS01中检测细胞存活度中评估兰花生长点萃取液对皮肤细胞型态变化的过程如下步骤：

S014取人类皮肤角质株化细胞培养在96孔培养板中，并96孔培养板放在37℃以及5％CO₂培养箱中培养至少24小时；

S015向S014中的96孔培养板加入1μL的萃取物，在不同时间梯度反应后，于显微镜下观察细胞形态并拍照记录。

4.根据权利要求1所述的一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，其特征在于，所述SS01中检测细胞存活度中评估皮肤细胞周期的过程如下步骤：

S021、取人类皮肤角质株化细胞培养在24孔培养板中培养至少24小时；

S022、加入10μL兰花生长点萃取物，于培养箱中反应；

S023、反应后取出上清液和细胞，并放入离心管中以1200rpm离心5分钟；移除上清液，加入300μL的PBS，缓慢震荡并逐滴加入700μL酒精固定细胞后移至微量离心管中，置于4℃冰箱储存；

S024、将微量离心管以1200rpm离心5分钟，移除上清液，依序加入445μL的PBS，5μL浓度为10mg/ml的核糖核酸酶A以及50μL浓度为10％的聚乙二醇辛基苯基醚，于37℃反应30分钟将人类皮肤角质株化细胞的RNA破坏分解后，以1200rpm离心5分钟并移除上清液后，加入400μL的PBS混合均匀后再加入5μL浓度为5mg/ml的聚酰亚胺溶液于4℃的温度下避光反应5分钟，以过滤膜过滤；

S025、使用流式细胞分析仪并配合Winmdi软件分析细胞周期分布比例。

5.根据权利要求2-4任意一所述的一种大白兰花生长点萃取物安全性检测方法，其特征在于，所述人类皮肤角质株化细胞在96孔培养板中的细胞密度为1×10⁴/well。