[发明专利]一种条件性neuritin knockin小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种条件性neuritin knockin小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

PCR扩增neuritin目的基因片段；

制备CTV线性化载体；

In-Fusion无缝克隆连接；

连接产物转化至stellar感受态细胞；

菌落PCR鉴定阳性克隆；

小量提取质粒；

质粒酶切鉴定及测序鉴定；

EndoFree Plasmid Maxi Kit大量提取测序正确的质粒并进行酶切鉴定；

单酶切使之线性化；

酚氯仿纯化；

电转导入胚胎干细胞；

PCR鉴定胚胎干细胞DNA；

将同源重组胚胎干细胞注射入囊胚；

所述菌落PCR鉴定阳性克隆的具体条件为：

1)用无菌枪头挑取一定数量的白色菌落，接种于新LB平板上，倒置放于培养箱中，37℃培养；

2)无菌牙签挑取单个菌落为模板至装有PCR反应体系的离心管中，使用两对引物分别进行PCR反应，反应引物为：

JUNLUO-F1∶5’-CACCACAAAGGAAAAAGCTGC-3’

JUNLUO-R1：5’-CAATCCGTAAGGGCTGTGAC-3’

JUNLUO-F2：5’-ACCTCAACATCCAAGGCAGC-3’

JUNLUO-R2：5’-TGAACTTCAGGGTCAGCTTGC-3’

反应体系为：

PCR反应，反应体系为：

所述单酶切使之线性化的具体条件为：

水浴，反应体系如下：

所述电转导入胚胎干细胞步骤具体为：

1)以丝裂霉素C处理的MEF细胞作feeder，培养ES细胞。ES细胞经过两次传代，生长至指数生长期用于Target实验；

2)Target实验

1.ES cell弃medium，DPBS清洗；

2.适量Trypsin-EDTA，CO2培养箱消化；

3.medium停止反应，转移至离心管，室温离心；

4.DPBS清洗，室温离心，弃液体；

5.将已线性化的载体DNA与细胞液混合，静置；

6.用滴管将混合液转移至电转杯；

7.伯乐电击仪电击，冰上静置；

8.将电击细胞转移至适量ES medium分装至含有Neo.R MEF的dish中，混匀，CO2培养；

3)G418筛选，从第二天开始，细胞每天换含有G418的新鲜medium；

4)挑克隆、冻板及阳性克隆鉴定。

2.根据权利要求1所述的条件性neuritin knockin小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR扩增目的片段及载体片段步骤中，以pcDNA3.1-Nrn1质粒为模板，Nrn1-F和Nrn1-R为引物进行PCR扩增Neuritin片段，同源序列通过PCR扩增引物添加。

3.根据权利要求2所述的条件性neuritin knockin小鼠模型的构建方法，其特征在于，将连接产物转化至Stellar感受态细胞步骤，具体为：

1)取2.5μL的连接片段加入盛有50μL Steller感受态细胞的1.5mL离心管中，用移液枪将其轻柔地吹吸混匀，冰上放置30min；

2)把离心管从冰上转移至42℃水浴锅中，静置45s，从水浴锅中取出后直接放置冰上2min；

3)向离心管中加入800μL提前在37℃水浴锅中加热的SOC培养基；

4)将离心管固定至37℃摇床，200rpm培养约1h；

5)培养好的菌液离心，移液枪吸弃上清至剩余约300μL时，吹吸混匀菌体，吸100ul用涂布棒均匀涂布于含有100μg/mL AMP的LB固体培养基平板上；

6)涂有菌液的平板倒置放入37℃培养箱中，过夜培养。

4.根据权利要求3所述的条件性neuritin knockin小鼠模型的构建方法，其特征在于，质粒酶切鉴定的具体条件为：