[发明专利]重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用，涉及基因工程领域。该基因工程菌的构建方法包括以下步骤：将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到草酸氧化酶的优化基因；敲除里氏木霉基因组中的pyr4基因和mus53基因，构建里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株；采用草酸氧化酶的优化基因构建重组表达载体；采用重组表达草酸氧化酶的载体，转化里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株，得到重组表达草酸氧化酶的基因工程菌。本发明的基因工程菌能够高效表达具有天然活性的草酸氧化酶，适用于研发重组草酸氧化酶药物、生产低草酸食品及饮料。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

草酸(oxalic acid)，即乙二酸，分子式为H₂C₂O₄，广泛存在于自然界中，常以草酸盐形式存在于植物如伏牛花、羊蹄草、酢浆草和酸模草的细胞膜，几乎所有的植物都含有草酸盐。在某些食物(如菠菜，绿茶，咖啡等)中含量很高。草酸在生物体内为最终产物，不能被进一步分解，主要排泄方式是随尿液一起排出。人体中的草酸包括外源性草酸和内源性草酸，外源性草酸是指通过饮食摄入的草酸，内源性草酸是指人体自身代谢产生的草酸，正常人体内的外源性草酸和内源性草酸含量基本相同。某些肾结石高发人群的外源性草酸远远大于内源性草酸。

人体内血液和尿液中的草酸含量过高时，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，而这些草酸钙晶体极易在膀胱、肾脏等器官内沉积形成结石。II型高草酸尿症是指食源性草酸吸收异常，导致尿草酸比正常人偏高，是除原发性高草酸尿症外导致结石的重要因素，因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸含量，从而降低患结石的风险。低草酸饮食或降解食物中的草酸是防治草酸钙结石最重要策略，目前在医学界已达成共识。

目前，已发现的能分解草酸的酶有草酸氧化酶、草酸脱羧酶和草酰辅酶A脱羧酶/甲酰辅酶A转移酶。草酸氧化酶(Oxalate Oxidase，以下简称OxOx)能专一性地将草酸分解为CO₂和H₂O₂，因此在诊断和治疗与草酸相关的疾病方面有着潜在的应用价值。草酸氧化酶虽然广泛存在于植物体内，但含量较低且提取纯化工艺复杂。草酸氧化酶在其他微生物(毕赤酵母、芽孢杆菌等)表达宿主中的表达水平也普遍不高，在原核表达系统E.coli中可以表达但不可溶，需要清洗包涵体，纯化，复性，程序繁琐。因此，开发产量高、安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用，本发明的基因工程菌能够高效表达具有天然活性的草酸氧化酶，适用于研发重组草酸氧化酶药物、生产低草酸食品及饮料。

本发明提供一种草酸氧化酶的优化基因，其编码的草酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在上述技术方案的基础上，该草酸氧化酶的优化基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供一种重组表达载体，其包含有草酸氧化酶的优化基因。

本发明提供一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，包括宿主细胞，所述宿主细胞中含有重组表达载体。

在上述技术方案的基础上，所述宿主细胞为里氏木霉。

本发明还提供上述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

S1、将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到草酸氧化酶的优化基因；

S2、构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株；