[发明专利]重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种草酸氧化酶的优化基因，其特征在于：其编码的草酸氧化酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组表达载体，其特征在于：其包含有如权利要求1所述的草酸氧化酶的优化基因。

3.一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，包括宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞中含有如权利要求2所述的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，其特征在于：所述宿主细胞为里氏木霉。

5.如权利要求4所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到如权利要求1所述草酸氧化酶的优化基因；

S2、构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株；

S3、敲除所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株的mus53基因，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株；

S4、采用所述草酸氧化酶的优化基因构建重组表达载体；

S5、采用所述重组表达载体转化所述里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株，得到重组表达草酸氧化酶的基因工程菌。

6.如权利要求5所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤S2的具体过程如下：

S201、提取里氏木霉基因组DNA；

S202、采用所述里氏木霉基因组DNA，构建里氏木霉表达质粒载体pMDT05；所述载体pMDT05的构建方法包括：

以pCAMBIA1300质粒为模板，使用表1中的引物pMDT05-F1和pMDT05-R1进行PCR扩增，得到的扩增产物进行分离，将约6.8kb的片段进行回收；

以所述里氏木霉基因组DNA为模板，使用表1中的引物Hyg-Pgpd-F和pMDT05-R2扩增启动子Pgpd，得到约1.4kb的启动子Pgpd片段；以pCAMBIA1300质粒为模板，使用表1中的引物pMDT05-F2和Pgpd-Hyg-R扩增潮霉素基因，得到约1kb的潮霉素基因片段；将上述扩增的启动子Pgpd片段和潮霉素基因片段按摩尔比1:1混合作为模板，使用引物pMDT05-F2和pMDT05-R2为上下游引物进行SOE-PCR扩增，得到约2.4kb的融合片段，融合片段进行分离，将约2.4kb的片段进行回收；

将上述的6.8kb片段和2.4kb片段按照摩尔比1:3混合，加入T4DNA连接酶和连接缓冲液，得到连接产物，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在卡那霉素抗性平板上筛选克隆子，用引物pMDT05-F2和pMDT05-R2进行验证，验证正确的质粒载体为里氏木霉表达质粒载体pMDT05；

S203、采用所述里氏木霉基因组DNA构建里氏木霉pyr4基因敲除盒，将所述载体pMDT05与所述里氏木霉pyr4基因敲除盒进行连接，得到里氏木霉pyr4基因敲除载体pMDT05-pyr4KO；

S204、将所述载体pMDT05-pyr4 KO通过根癌农杆菌介导转化里氏木霉，得到里氏木霉pyr4基因缺失突变株；

步骤S3的具体过程如下：

S301、采用所述里氏木霉基因组DNA构建里氏木霉mus53基因敲除载体pMDT05-mus53KO；

S302、采用所述载体pMDT05-mus53KO通过根癌农杆菌介导法转化所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株。

7.如权利要求4所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌在制备草酸氧化酶中的应用，其特征在于，采用所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌制备草酸氧化酶的过程包括以下步骤：

将所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌进行培养发酵，得到发酵液，从发酵液中提取草酸氧化酶。