[发明专利]一种利用散布序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法

权利要求书

1.一种散布序列，其特征在于所述散布序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种利用权利要求1所述的散布序列鉴定甘蔗中包含斑茅血缘的方法，其特征在于鉴定步骤如下：

（1）根尖细胞玻片的制备：28 °C恒温保湿的条件下培养蔗茎，取根尖用1, 4-二氯苯-α-溴代萘饱和水溶液预处理后转入卡诺氏固定液固定；固定后的根尖于ddH₂O中低渗并置于37 °C条件下混合酶中酶解2-4 h，酶解的根尖分生区细胞涂抹于干净的玻片上晾干，获得根尖玻片；所述混合酶为4 % Onozuka R10 cellulose、0.5 % pectolyase Y-23和0.5 %pectinase，由4 g Onozuka R10 cellulose、0.5 g pectolyase Y-23和0.5 g pectinase加入到95 mL pH 4.5酶解缓冲液中配制而成，其中pH 4.5酶解缓冲液由0.147 g柠檬酸钠、0.105 g柠檬酸、0.28 g氯化钾加入50 mL ddH₂O配制而成；所述诺氏固定液为无水乙醇和冰醋酸，体积比为3︰1；

（2）标记探针的制备：配制50 μL反应液，其中包含25 μL 0.4~1 mM dNTP mix withDigoxigenin，5 μL 10 × DNase I buffer，1~3 μL 0.005 U/μL DNase I，2~4 μL 5 U/μLDNA pLoymease I，5 μg质粒，用ddH₂O补足至50 μL；反应液在15℃条件下反应1.5-2 h，获得Digoxigenin标记的散布序列，即标记探针；所述质粒由散布序列连接到pMD19-T载体中获得；散布序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（3）根尖玻片的预处理：将根尖玻片置于37 °C含100 µg/mL RNase A的2 × SSC溶液中消化1 h；转入含500 µg/mL胃蛋白酶的0.01 M HCL溶液中处理30 min，然后用pH7.4磷酸盐缓冲液冲洗1次；最后于室温下，0.1 × SSC冲洗1次，晾干后置于含70 %去离子甲酰胺的SSC溶液中80 °C变性3 min；变性后的根尖玻片，立即置于-20 °C预冷的体积浓度70 %、95%和100 %的梯度乙醇中，各脱水5 min，然后置于空气中干燥，获得预处理根尖玻片；

（4）配制变性杂交混合液：配制50 µL杂交混合液，杂交混合液包含25 µL去离子甲酰胺、10 µL 500 mg/mL硫酸葡聚糖、5 µL 20 × SSC，1.5 µL 200 mg/mL十二烷基硫酸钠和1~5 µL标记探针；将50 µL杂交混合液放入98 °C中变性10 min，然后立即置于冰水中10min，保存在-20 °C，获得变性杂交混合液，备用；

（5）变性杂交混合液与预处理根尖玻片的杂交：将50 µL变性杂交混合液加到预处理根尖玻片上，盖上塑料盖膜，于37 °C杂交过夜，获得杂交玻片；将杂交玻片转入42 °C的2 ×SSC中漂洗5 min后，置于42 °C的4 × SSC/Tween中漂洗5 min；然后加入50 µL 含49 µL抗体稀释液和1 µL 200 µg/mL抗Digoxigenin荧光素抗体，置于37 °C温育1 h；然后，置于37°C的4 × SSC/Tween中洗脱3次，每次10 min；再加入50 µL 含49.5 µL抗体稀释液和0.5 µL 400µg/ mL荧光标记的兔抗绵羊IgG抗体，置于37 °C温育1 h；然后，置于37 °C的4 ×SSC/Tween中洗脱3次，每次10 min；获得洗脱的杂交玻片；最后在洗脱的杂交玻片上加入100 μL 3 µg/mL DAPI复染后，加入抗褪色剂封片并镜检；如果待测样品中含有结合靶序列的标记探针，就产生绿色荧光信号，则判定该待测样品包含斑茅血缘，为甘蔗与斑茅真实杂交后代。