[发明专利]一种新的基因组甲基化文库的构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种甲基化测序文库的构建方法。具体地，本发明通过重亚硫酸盐处理构建文库，可同时检测经CT转化的原始链和未经CT转化的互补链序列，直接找出甲基化位点；本发明构建的文库保留了一半未经CT转化的碱基，可大大提高文库碱基平衡性，大幅提高测序质量。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体地涉及一种新的基因组甲基化文库的构建方法和应用。

背景技术

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶作用下，将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的生化过程。DNA甲基化是最早发现的一种可逆、可遗传的基因表观修饰方式之一，DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化异常是癌症中一种常见的表观遗传学改变，大量研究表明甲基化异常与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。近年来全基因组甲基化的高通量测序分析让研究人员能够通过甲基化基因组的测序而鉴定和追踪甲基化模式。

DNA甲基化高通量测序的方法常见的有如下几种：

1.甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)

MeDIP-Seq法基于DNA免疫共沉淀技术，通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后进行高通量测序。该方法可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究，但缺点是无法获得单碱基分辨率的信号。

2.全基因组甲基化测序(WGBS)

WGBS法基于全基因组重亚硫酸盐转化方法，和Illumina高通量测序平台相结合，是目前甲基化测序的金标准。基因组样品经重亚硫酸盐处理后，甲基化的胞嘧啶(C)保持不变，未发生甲基化的胞嘧啶(C)转换成尿嘧啶(U)，在PCR扩增后变成胸腺嘧啶(T)，与原本具有甲基化修饰的胞嘧啶(C)区分开来。再结合高通量测序，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。但要达到要求的测序深度，测序成本比较高。

3.简化基因组甲基化测序(RRBS)

RRBS法基于酶切原理，利用限制性内切酶MspI对基因组进行酶切富集CpG区域，再经重亚硫酸盐处理后进行高通量测序。该技术显著提高了CpG区域的测序深度，降低测序成本，但受内切酶位点限制，不能完全覆盖CpG区域。

基于重亚硫酸盐转化的甲基化测序，可将DNA修饰信息转化为碱基信息，但在BS转化过程中DNA经历极端环境处理，最终会造成较大的损伤，并且DNA以单链和双链的混合状态存在，如用传统WGBS的双链连接接头构建文库，BS转化过程导致～90％的DNA模板丢失,使得建库起始量高，有效数据量低。有优化建库流程可先BS转化再从单链DNA构建文库，这种策略可降低BS处理对预文库的损伤，提高模板利用率，降低建库起始量，一定程度上可增加有效测序数据。但BS转化后基因组中大多数的胞嘧啶(C)都会转变为胸腺嘧啶(T)，造成碱基不平衡，在生物信息学分析过程中大大降低含有非甲基化胞嘧啶的reads比对率，导致不能得到完整的全基因组甲基化图谱，限制了WGBS的实际应用。

因此，本领域迫切需要开发新的基因组甲基化文库的构建方法，以弥补WGBS文库构建流程中BS转化对DNA损伤和文库碱基不平衡的缺陷，拓宽甲基化研究的应用范围。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的基因组甲基化文库的构建方法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种甲基化测序文库的构建方法，所述方法包括步骤(图1)：

(a)提供一待测样本，将样本中的DNA打断，从而得到片段化DNA；

(b)将所述片段化DNA的5′-磷酸基团去除，从而得到5′去磷酸化DNA；

(c)对所述5′去磷酸化DNA进行补平反应，从而得到5′去磷酸化的平末端DNA；