[发明专利]一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶生产菌株及其固定化方法

权利要求书

1.一种表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC M2016536为宿主，以pHY300PLK为表达载体表达来源于解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法为：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因连接到表达载体pHY300PLK上，构建重组质粒pHY300PLK-DPEase，将重组质粒pHY300PLK-DPEase转入枯草芽孢杆菌后得到重组菌。

3.应用权利要求1或2所述重组菌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：将重组菌接种于LB液体培养基中，于35-38℃、150-250rpm培养8-10h，然后以3-6％的接种量接种至TB培养基中，于30-33℃、150-200rpm培养40-52h；将获得的发酵液稀释至OD₆₀₀为4-5后，超声破壁离心后即获得破壁上清粗酶液。

4.一种固定化细胞方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)培养权利要求1或2所述的重组菌得到发酵液，将发酵液离心后用缓冲液复溶，添加硅藻土；

2)将步骤1)所得的菌悬液与海藻酸钠溶液均匀混合，调节细胞终浓度；

3)将步骤2)所得的混合液用针式注射器以40-60滴/min的速度滴入CaCl₂中成型，4-6℃静置硬化2-3h；

所述步骤1)中硅藻土的添加量按质量分数为1％；

所述步骤2)中海藻酸钠的添加量按质量分数为2％，调节细胞终浓度为50g/L；

所述步骤3)中CaCl₂的添加量按质量分数为2％。

5.根据权利要求4所述固定化细胞方法得到的固定化细胞。

6.权利要求5所述的固定化细胞在制备D-阿洛酮糖上的应用。