[发明专利]一种G6PD基因突变的检测方法及其引物组

说明书

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于G6PD基因突变的检测方法及其引物组。本发明对G6PD基因的4个热点突变位点的核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶缺乏症遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对G6PD基因突变位点检测的引物组，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对G6PD基因突变进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。

背景技术

小儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症为红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）显著缺乏所致的一组遗传性溶血性疾病，俗称蚕豆病。全世界约2亿人罹患此病。我国是本病的高发区之一，呈南高北低的分布特点，患病率为0.2%～44.8%。主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。G-6-PD缺乏症发病原因是由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。其发病情况颇为繁杂，如蚕豆病只发生于G-6-PD缺乏者，但并非所有的G-6-PD缺乏者吃蚕豆后都发生溶血；曾经发生蚕豆病者每年吃蚕豆，但不一定每年都发病；发病者溶血和贫血的程度与所食蚕豆量的多少并无平行关系；成年人的发病率显著低于小儿。

G-6-PD缺乏症为X伴性不完全显性遗传，男性发病多于女性。通常显性遗传的特点是父母任一方的致病基因只要传给子女，都可导致发病。有些携带显性遗传基因的个体可无临床表现，即外显率不是100%，这种情况就是不完全显性。也就是父母可能有一方是显性基因携带者而无临床表现的，正如G-6-PD缺乏症一样，因属于X连锁，群体中出现外显不全现象，称X连锁不完全显性遗传。还有一个可能就是基因突变，不过这个概率极小。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症致病基因突变位点：

覆盖人群比例：

杜传书、赵崇义和唐堂等在中国大陆和台湾省的中国人G6PD缺乏症患者中鉴定出来11中突变种类。在大陆的患者中，常见的基因突变类型为nt1388(G>A)、nt1376(G>T) 、nt95(A>G)三种，占分析病例数的70%以上；台湾省患者中，最常见的突变类型为nt1376(G>T)占52%，nt1388(G>A)和nt493(A>G)分别占16%和10%，即80%的G6PD患者是由这三个突变引起的。

目前检测G6PD基因突变位点的方法有DHPLC、PCR-SSCP、PCR-DGGE、ARMS、HRM、限制性内切酶消化试验、经典测序等，存在通量低、成本贵等问题，对PCR产物长度也有一定限制。

Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H⁺，H⁺在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H⁺ 的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。