[发明专利]一种PAH基因突变的检测方法及其引物组

说明书

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，具体公开了一种用于检测PAH基因突变的方法及其引物组。本发明对苯丙酮尿症致病基因PAH的7个热点突变位点的核酸序列进行分析，设计相应的引物，对样本基因组DNA特定位点经过多重PCR扩增，最后以Ion Torrent半导体芯片测序技术进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，检测速度快等优点。为苯丙酮尿症遗传学方面的检测、测试、分析和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，从而为该类疾病的临床诊断提供理论基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学基因技术领域和医学领域，涉及用分子生物学方法对PAH基因突变位点检测的引物组，特别涉及用Ion Torrent半导体芯片测序技术对PAH基因突变位点进行定性、定量检测的相关引物组及其试剂盒。

背景技术

苯丙酮尿症（PKU）是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸（PA）代谢途径中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出。本病在遗传性氨基酸代谢缺陷疾病中比较常见，其遗传方式为常染色体隐性遗传。临床表现不均一，主要临床特征为智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等、脑电图异常。如果能得到早期诊断和早期治疗，则前述临床表现可不发生，智力正常，脑电图异常也可得到恢复。

苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一。正常人每日需要的摄入量约为200～500毫克，其中1/3供合成蛋白，2/3则通过肝细胞中苯丙氨酸羟化酶（PAH）的转化为酪氨酸，以合成甲状腺素、肾上腺素和黑色素等。苯丙氨酸转化为酪氨酸的过程中，除需PAH外，还必须有四氢生物蝶呤（BH4）作为辅酶参与。基因突变有可能造成相关酶的活性缺陷，致使苯氨酸发生异常累积。

苯丙酮尿症致病基因PAH的常见突变位点：

中国人中典型的苯丙酮尿症患者中已经发现近20种突变类型，常见的有7种，列在上表中，总计约覆盖70%突变个体。

目前检测苯丙酮尿症致病基因PAH突变位点的方法有PCR-RFLP、RT-PCR、经典测序、溶解曲线分析等，存在通量低、成本贵等问题，对PCR产物长度也有一定限制。

Ion Torrent半导体芯片测序技术是新一代的测序技术，它的核心技术是使用半导体技术在化学和数字信息之间建立直接的联系。在半导体芯片的微孔中的微球上固定DNA链，随后依次掺入单核苷酸dGTP、dCTP、dATP、dTTP。随着每个碱基的掺入，释放出H⁺，H⁺在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H⁺ 的检测，实时判读碱基。由于其化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度，一台仪器即可适合各种测序通量需求的科学研究，在较短的时间内获得真实可靠的实验结果。

Ion Torrent半导体芯片测序技术与传统Sanger法及二代测序技术比较，IonTorrent技术有以下优势：系统无激光光源，无光学系统，无照相系统；使用无标记的核苷酸及酶进行测序，本底干扰低；通过对 H⁺的检测，可以改善碱基判读准确性；测序通量大、速度快，完成1G通量的测序检测仅需2~3小时，是传统Sanger测序方法通量的数千倍以上，同时弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷。

目前尚没有报道Ion Torrent半导体芯片测序技术专门用于PAH基因突变的检测。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供针对PAH基因突变的定性、定量检测的方法及其引物。

为解决上述问题，本发明采取以下技术方案：