[发明专利]梅花鹿鉴定引物及方法和应用

说明书

本发明涉及一种梅花鹿鉴定引物及方法和应用，属于物种鉴定技术领域。该鉴定引物包括：内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。该引物能够特异性的快速扩增梅花鹿核酸，解决鹿茸在“真伪”鉴别上的瓶颈性难题。

技术领域

本发明涉及物种鉴定技术领域，特别是涉及一种梅花鹿鉴定引物及方法和应用。

背景技术

鹿茸是指梅花鹿的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角，是名贵药材。鹿茸中含有磷脂、糖脂、胶脂、激素、脂肪酸、氨基酸、蛋白质及钙、磷、镁、钠等成分，其中氨基酸成分占总成分的一半以上。李时珍在《本草纲目》上称鹿茸“善于补肾壮阳、生精益血、补髓健骨”，为一种传统的名贵中药。

但是，目前市场上大量的鹿茸制品真伪不用，存在鉴别上的难题，亟需一种快捷、理想、可靠的标准化、规范化的鉴别方法。

2000年，Notomi等发明了环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP)，可以在等温条件下实现核酸扩增。LAMP技术的反应原理是，根据序列保守区域设计的一对外引物，一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上的六个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～67℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列六个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，检测时间大大缩短，而且快速敏感。目前，LAMP技术在细菌和病毒检测、耐药基因检测、寄生虫检测、胎儿性别鉴定等方面被广泛应用。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种梅花鹿鉴定引物及方法，采用该引物及方法，能够快速检梅花鹿核酸，为鹿茸等动物类药材的标准化鉴定提供新的思路，解决鹿茸在“真伪”鉴别上的瓶颈性难题。

一种梅花鹿鉴定引物，包括以下引物：

内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；

内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；

外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；

外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；

环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；

环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。

上述引物，是发明人根据梅花鹿基因组的特点，经过反复实验后得到，其中，核心区域F1(FIP后段)和LF被放置到梅花鹿特异插入片段，保证了该套引物的特异性。该套引物用于扩增非梅花鹿核酸时，由于缺失了该片段，扩增时，导致FIP引物不能形成环状哑铃状结构，因此无法进行LAMP指数扩增，从而不能扩增非梅花鹿核酸。此外，环引物LF也位于特异性的插入片段，仅仅只有当扩增梅花鹿核酸时才能进行加速扩增，进一步保证了特异性。

在其中一个实施例中，所述内引物FIP和BIP的工作浓度为35-45pmol，所述外引物F3和B3的工作浓度为8-12pmol，所述环引物LF和LB的工作浓度为16-24pmol。采用上述浓度配比，具有较好的扩增效率。

本发明还公开了一种梅花鹿鉴定方法，包括以下步骤：