[发明专利]梅花鹿鉴定引物及方法和应用

权利要求书

1.一种梅花鹿鉴定引物，其特征在于，包括以下引物：

内引物FIP：TGTCCTATACACCGATTTATGTGCTGCAAAACACGTGATATAACCT；

内引物BIP：TGCCCCATGCTTATAAGCATGTGTACGATGAACAACATCATG；

外引物F3：TCTATGTCCTACTAATTACAC；

外引物B3：GACTGATTTGACTTAATGCAC；

环引物LF：ACACGTGTGTCTTAATGTAC；

环引物LB：TCCTATCATTTATAGTACATAGT。

2.根据权利要求1所述的梅花鹿鉴定引物，其特征在于，所述内引物FIP和BIP的工作浓度为35-45pmol，所述外引物F3和B3的工作浓度为8-12pmol，所述环引物LF和LB的工作浓度为16-24pmol。

3.一种梅花鹿鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

环介导恒温核酸扩增：采用权利要求1-2任一项所述的引物对待测样品的基因组进行扩增；

判定：通过测定反应液的浊度，浊度上升为阳性反应，即该样品为梅花鹿样品，浊度无变化为阴性反应，即该样品为非梅花鹿样品；

和/或

往反应液中加入钙黄绿素指示剂，反应液为绿色为阳性反应，即该样品为梅花鹿样品，反应液橙色为阴性反应，即该样品为非梅花鹿样品。

4.根据权利要求3所述的梅花鹿鉴定方法，其特征在于，所述环介导恒温核酸扩增步骤中，扩增反应体系为25μl，包括如下组分：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase；

引物加入量为：40pmol内引物FIP和内引物BIP，20pmol环引物LF和环引物LB，5pmol外引物F3和外引物B3。

5.根据权利要求3所述的梅花鹿鉴定方法，其特征在于，所述环介导恒温核酸扩增步骤中，扩增反应的温度为60-62℃，扩增反应的时间为60-70min。

6.根据权利要求3所述的梅花鹿鉴定方法，其特征在于，所述判定步骤中，钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。

7.权利要求1所述的梅花鹿鉴定引物在鉴定梅花鹿品种中的应用。

8.一种梅花鹿鉴定试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物。

9.根据权利要求8所述的梅花鹿鉴定试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、环介导恒温核酸扩增试剂、显色指示剂和缓冲溶液中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的梅花鹿鉴定试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照试剂和阴性对照试剂。