[发明专利]用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针

说明书

本发明公开了用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，RPA专用引物的正向引物序列为CAATCAGGGTCAGTGGACGAGACTGGCGTTGT，反向引物序列为CCTCCCAGAGCCATGTTACCCGGTCTGAAGGA；探针序列为(FAM)cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgccaTc(THF)gTggaggcttcaaaggc(C3spacer)；包括上述RPA专用引物和探针的RPA试剂盒能在15min内恒温37℃条件下，可视化检测II型鲤疱疹病毒。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及II型鲤疱疹病毒的检测技术，具体涉及用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，及在检测II型鲤疱疹病毒的应用。

背景技术

2009-2010年鲫鱼“病毒性出血病”在江苏省苏北射阳县鲫鱼养殖池塘零星发生，引起发病池塘的鲫鱼死亡，2011年8-9月份在盐城地区出现较大面积的暴发，并引起大面积死亡，2012年3月开始发现少数鲫鱼池塘发病，6月份大规模暴发，在射阳县该病发生池塘高达80％，在苏北其他鲫鱼养殖区的发病情况同样严峻，本次流行的鲫鱼“病毒性出血病”被确定为鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusII,CyHV-II)。

疱疹病毒科(Herpesviridae)属于双链DNA病毒，具囊膜、球形、形状多样化，直径为120-200nm，表面有明显的囊膜，具钉状物。核衣壳20面体对称，直径100-110nm，表面有一层由球状物组成的覆膜，球状物不对呈的分布，数量也不同。病毒衣壳内包裹大的双链DNA。该科病毒有3个亚科，分别是α型疱疹病毒(Alphaherpesvirinae)、β型疱疹病毒(Betaherpesvirinae)和γ型疱疹病毒(Gammaherpesvirinae)。在鱼类中报道的疱疹病毒科，暂被ICTV化为待分类疱疹病毒：鱼疱疹样病毒属(Ictalurid herpes-like viruses)病症，病鱼身体发红，侧线鳞以下及胸部尤为明显，鳃盖肿胀，在鳃盖张合的过程中(或鱼体跳跃的过程中)，血水会从鳃部流出；病鱼死亡后，鳃盖有明显的出血症状，剪开鳃盖观察，鳃丝肿胀并附有大量粘液。

CyHV-II的常规检测技术如LAMP技术，其反应原理复杂，引物设计繁琐，并且在引物设计时针对靶标序列所需要的保守区段较为严格，反应产物不均一，不利于后期的测序构建克隆，因此没有得到普遍应用；PCR技术耗时较长，成本较高，而且需要精密的温度循环仪器，严重限制PCR技术在现场检测中的应用。近年来，恒温核酸扩增技术的出现恰可解决PCR技术局限，更加方便，迅速，是一种快速检测CyHV-II的可行性方法。重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification，RPA)是恒温核酸扩增技术的一种，RPA利用T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs X和uvs Y、单链结合蛋白gp32及Bsu DNA聚合酶三种酶在37-42℃对目标片段进行等温扩增，可以在20-40min完成数十亿的DNA拷贝，基于该技术与凝胶电泳，侧向流动免疫层析技术(LFD)可以实现CyHV-II的快速检测。

发明内容

为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-meraseamplification，RPA)与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合，能在15min内恒温37℃条件下可视化检测II型鲤疱疹病毒。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：