[发明专利]B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法

说明书

本发明公开了一种B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法；该方法针对B型流感病毒HA基因基因保守区域设计了一组引物及两条探针SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示，两条探针选择不同的荧光标记，实现了一管反应体系中同时对两种型别的B型流感病毒进行鉴定，简化了疑似B型流感病毒感染病例的确诊流程。同时公开了待检样本的处理、荧光RT‑PCR反应体系及反应条件。本发明可以实现对我国大陆流行的B型流感病毒两种型鉴定，操作简单、应用方便，为呼吸道感染病原学和临床流行病学研究提供了可行的技术方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。

背景技术

流感是以一种由A型、B型或C型流感病毒引起的急性呼吸道疾病，呈季节性流行或局部暴发特征。流感病毒属于正粘病毒科，是一种单链负义RNA病毒，基因组分节段。其中A型流感病毒常引起世界范围内的流感大流行，而B型则是季节型流行趋势。与A型流感不同，人类是B型流感病毒的唯一宿主，B型流感病毒不分HA和NA亚型，而是划分为抗原不同的两个分支，即Victoria系和Yamagata系。

每年B型流感病毒一个或两个分支，与季节性H1N1或季节性H3N2亚型流感病毒共流行，每年全球大概由8％的人感染流感病毒，约2％的人是由B型流感病毒感染引起的，发病率仅次于季节性H3N2亚型流感病毒。有研究报道结果显示，流感病毒感染引起的死亡中有29％是由B型流感病毒导致的。

由于Real-time RT-PCR(rRT-PCR)的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。通过rRT-PCR方法对流感病毒型别进行鉴定，能够在较短时间内对疑似感染样本进行确诊，该方法应用于临床标本检测时，可用于呼吸道病原监测以及临床流行病学研究。应用rRT-PCR方法对病毒核酸进行检测时，其难点之一在于在病毒的变异为引物和探针设计带来困难，为了准确对流行中的流感病毒进行鉴定，需要定期对流行毒株的序列进行比对和分析，如分型鉴定引物探针不再适用于流行的毒株，则需要对引物和探针序列进行更新。其二在于对不同的亚型或亚系进行鉴定的探针使用相同的荧光标记，同一检测反应体系中只能对一种亚型或亚系的流感病毒进行分型鉴定，如果需要对多个亚型或亚系进行分型鉴定，则需要更多的标本量，反应体系的配置和鉴定结果报告时间相应的增加。本发明选择在相对保守区域设计引物探针，选用特异性高的引物和Taqman探针，能够快速特异性地检测B型流感病毒，同时选用两种不同的荧光标记探针，优化了反应体系中引物和探针的浓度，避免了多重荧光反应体系中不同引物之间干扰，实现单次检测即可对两种亚系的B型流感病毒进行分型鉴定，进一步简化操作，节省检测时间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提出一种操作简单、应用方便的B型流感病毒分型鉴定用引物探针和鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种rRT-PCR引物和探针组合，所述引物和探针包括长度为22～27bp的用于扩增B型流感病毒Victoria系和Yamagta系HA基因的寡核苷酸片段。

优选的，所述rRT-PCR引物和探针组合包括针对B型流感病毒Victoria系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.3所示的探针，以及针对B型流感病毒Yamagata系的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ IDNo.4所示的探针。

优选的，针对B型流感病毒Victoria系的探针两端的标记为FAM、BHQ1荧光素标记；针对B型流感病毒Yamagata系的探针两端的标记为HEX、BHQ1荧光素标记。具体如下：

第一组引物和探针包括：